多壁碳納米管固相萃?。咝б合嗌V－串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品接觸材料中雙酚－二環(huán)氧甘油醚的遷移量

吳新華， 丁 利， 李忠海， 張彥麗， 劉曉霞， 王利兵＊

（1.湖南省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，食品安全科學(xué)技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長沙410004）

近年來，食品罐頭、嬰兒奶瓶、微波爐飯盒及其他許多食品接觸材料中都用到了雙酚A二縮水甘油醚（BADGE）、雙酚F二縮水甘油醚（BFDGE）等環(huán)氧樹脂作為內(nèi)涂層［1］。其中BADGE和BFDGE會在食品接觸材料的加工和儲藏過程中向內(nèi)容物遷移，造成污染，并形成水合物、氯代物等衍生物［2－4］。有研究報道，微量甚至痕量的雙酚A及其環(huán)氧化合物即可能對動物生理活動、生殖系統(tǒng)以及胎兒發(fā)育造成不良影響［5］。鑒于其存在多種食品安全隱患，內(nèi)涂料中雙酚二縮水甘油醚及其衍生物遷移量的分析方法是各國食品安全檢測的研究熱點(diǎn)。

多壁碳納米管（MWCNTs）是一種新興的以碳為基礎(chǔ)的納米材料，具有一系列新異的物理化學(xué)特性。由于MWCNTs較大的比表面積及其特有的疏水性和結(jié)構(gòu)，應(yīng)用MWCNTs為基質(zhì)進(jìn)行固相萃?。⊿PE）受到越來越多的關(guān)注［6，7］。

目前對雙酚－二環(huán)氧甘油醚遷移量檢測的方法主要為高效液相色譜法（HPLC）［8，9］、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（LC－MS）［10］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（GCMS）［11］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC－MS／MS）［12］等。本文采用MWCNTs為SPE柱填料，采用HPLC－MS／MS分析食品接觸材料中的雙酚－二環(huán)氧甘油醚向內(nèi)容物的遷移量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

API 4000三重四極桿質(zhì)譜儀（美國ABI公司）配有島津公司的高效液相色譜儀；SPE裝置（美國Supelco公司）；高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；多功能微量化樣品處理儀（湖南長沙中訊電子工程研究所）。

叔丁基甲醚（MTBE）、甲醇、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純（德國Merck公司）；乙酸銨為色譜純（北京化工廠）；水為超純水。

MWCNTs（直徑20～30 nm，長度5～10μm，廣東深圳納米港公司）；雙酚－二環(huán)氧甘油醚標(biāo)準(zhǔn)品：BADGE、雙酚A（2，3－二羥丙基）甘油醚（BADGE· H2O）、雙酚A（3－氯－2－羥丙基）甘油醚（BADGE· HCl）、雙酚A（3－氯－2－羥丙基）（2，3－二羥丙基）醚（BADGE·H2O·HCl）、BFDGE、雙酚F雙（3－氯－2－羥丙基）甘油醚（BFDGE·2HCl）純度均≥95%（美國Sigma公司）；藠頭罐頭、蓮子罐頭、魚肉和牛肉罐頭購自本地超市。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，用甲醇定容至10 mL，配成1.0 g／L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4℃避光保存。取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇配成100 mg／L的中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃冷藏避光儲存。取適量儲備液，用甲醇定容配1.0 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)工作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 MWCNTs SPE柱的制備

除去商品化的SPE小柱中的填充物，徹底清洗小柱和聚乙烯墊圈。干燥小柱和墊圈后，用墊圈封住小柱的底部，稱取0.25 g MWCNTs于SPE柱中，然后用墊圈封住小柱頂部，壓緊MWCNTs，使其高度大約為1.8 cm。使用前先用5 mL甲醇、5 mL水進(jìn)行活化。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入15 mL MTBE，旋渦振蕩1 min，超聲提取20 min后，以7 500 r／min離心5 min，分離上清液。下層殘渣再用5 mL MTBE采用上述步驟重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。將提取液置于多功能微量化樣品處理儀上40℃吹至近干，用5 mL甲醇－水（50∶50，v／v）溶解，脂肪含量較高的食品需再加2 mL正己烷，混勻后棄去正己烷層，待凈化。

1.4.2 凈化

將上述提取液加載到活化后的MWCNTs SPE小柱上，控制流速為1 mL／min，棄去流出液，再用5 mL水淋洗，棄去淋洗液。最后用5 mL甲醇－乙酸乙酯（60∶40，v／v）洗脫，收集合并全部洗脫液，于多功能微量化樣品處理儀上40℃吹至近干，用甲醇－水（50∶50，v／v）定容至1 mL，過0.45μm濾膜，供HPLC－MS／MS分析。

1.5 色譜條件

色譜柱為COSMOSIL C18柱（150 mm×2 mm，2.5μm）；柱溫為30℃。流動相A為甲醇，B為含有0.1%甲酸的5 mmol／L醋酸銨溶液。梯度洗脫程序：0～10 min，40%B～5%B；10～15 min，5%B；15～16 min，5%B～40%B；16～20 min，40%B。流速為0.25 mL／min。進(jìn)樣量為10μL。

1.6 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正離子掃描；霧化氣壓力為413 kPa；輔助氣壓力為448 kPa；離子噴霧電壓為5 500.00 V；氣簾氣壓力為137 kPa；離子化溫度為500℃；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測掃描（MRM）模式。6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量和去簇電壓見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式下檢測6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚的部分質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for multiple reaction monitoring detection of 6 exogenous endocrine disruptors

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

利用流動注射泵連續(xù)進(jìn)樣，將每種質(zhì)量濃度為100μg／L的雙酚－二環(huán)氧甘油醚標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入離子源中，在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描以選擇適當(dāng)?shù)姆肿与x子峰。結(jié)果表明，ESI＋電離模式下，目標(biāo)化合物全掃描的準(zhǔn)分子離子［M＋NH4］＋最理想。對該準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描（子離子掃描），得到離子碎片信息，獲得二級質(zhì)譜圖。然后對去簇電壓、碰撞氣能量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，使分子離子和特征碎片離子對強(qiáng)度達(dá)到最佳。在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下，目標(biāo)物的總離子流MRM色譜圖見圖1。由圖1可見，6種分析物離子選擇性好，峰形尖銳對稱。

圖1 6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（5μg／L）的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 6 bisphenol diglycidyl ethers（5μg／L）Peaks：1.BADGE·H2O；2.BFDGE；3.BADGE·H2O·HCl；4.BFDGE·2HCl；5.BADGE；6.BADGE·HCl.

2.2 提取溶劑的選擇

在實(shí)驗(yàn)過程中，提取溶劑的選擇是關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)分別比較了甲醇、乙腈、MTBE和乙酸乙酯作為提取溶劑對雙酚－二環(huán)氧甘油醚提取效率的影響，用上述溶劑超聲提取罐頭食品中的雙酚－二環(huán)氧甘油醚的回收率見圖2所示。由圖2可以看出，用MTBE作為提取溶劑，6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚的回收率最好，因此本實(shí)驗(yàn)采用MTBE作為提取溶劑。同時比較了超聲作用時間的影響，當(dāng)超聲作用15 min時，雙酚－二環(huán)氧甘油醚能充分提取。

圖2 不同溶劑提取罐頭食品樣品中雙酚－二環(huán)氧甘油醚的回收率Fig.2 Recoveries of bisphenol diglycidyl ethers in canned foodstuffs by different extraction solvents

2.3 MWCNTs用量的選擇

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MWCNTs的用量對實(shí)驗(yàn)有一定影響，用量過少則不能完全吸附目標(biāo)物，用量過多則會影響上樣時的流速。實(shí)驗(yàn)中制備不同填充質(zhì)量的MWCNTs SPE小柱，MWCNTs用量從150 mg到 400 mg。稱取幾份空白樣品各2.0 g并添加20 ng／g的標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.4.1節(jié)所述步驟進(jìn)行前處理，分別上樣到上述SPE小柱，流速控制在1.0 mL／min，以6 mL甲醇－乙酸乙酯（50∶50，v／v）洗脫，回收率情況見圖3。由圖3可知，250 mg MWCNTs已能完全吸附6種目標(biāo)物，用量過多不但回收率沒有增加，反而會影響上樣速率及洗脫效率。綜合考慮，選定最佳的MWCNTs用量為250 mg。

圖3 MWCNTs用量對回收率的影響Fig.3 Effect of MWCNTs dosage on recoveries

2.4 洗脫溶劑及其體積的優(yōu)化

當(dāng)添加20 ng／g待凈化提取液到活化的MWCNTs SPE小柱后，分別比較了甲醇、乙腈和乙酸乙酯洗脫效率，洗脫溶劑體積為6 mL，流速控制在1.0 mL／min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：用甲醇洗脫時，BFDGE和BFDGE·2HCl的回收率不是很好，其余4種目標(biāo)物都能達(dá)到80%以上；乙腈洗脫時的回收率不如甲醇好；乙酸乙酯洗脫時BFDGE和BFDGE ·2HCl的回收率能達(dá)到80%以上，但是其余4種均比較低，因此采用單一的溶劑無法從MWCNTs柱上把目標(biāo)物全部洗脫下來。綜合比較3種溶劑的洗脫效率，甲醇和乙酸乙酯的洗脫能力剛好互補(bǔ)，因此采用甲醇和乙酸乙酯混合溶液作為洗脫溶劑。考察了采用不同體積比的甲醇和乙酸乙酯洗脫時對回收率的影響，結(jié)果（見圖4）表明甲醇和乙酸乙酯的體積比為60∶40時，各化合物的回收率最好。

圖4 甲醇比例對回收率的影響Fig.4 Effect of methanol volume proportion on recoveries

考察不同體積下洗脫液對回收率的影響，洗脫溶劑為甲醇－乙酸乙酯（60∶40，v／v），流速控制在1.0 mL／min，不同洗脫溶劑體積對回收率的影響見圖5?？梢钥闯?，隨著洗脫體積的增大，雙酚－二環(huán)氧甘油醚的回收率雖然也不斷增大，但當(dāng)洗脫液體積大于5 mL時，回收率的增長緩慢。綜合考慮溶劑體積和回收率，最終選定洗脫液體積為5 mL。

圖5 洗脫體積對回收率的影響Fig.5 Effect of eluent volume on recoveries

2.5 方法的線性范圍與檢出限

對6份空白藠頭樣品按1.4節(jié)所述步驟進(jìn)行提取凈化并吹干，向其殘余物中依次加入用甲醇配制成的1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和100.0μg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，充分溶解后得到系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，過濾膜后進(jìn)行HPLC－MS／MS分析，以目標(biāo)物在MRM模式下的峰面積（Y）對相應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)量濃度（X，μg／L）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。6種化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LOD，S／N＝3）見表2。

表2 雙酚－二環(huán)氧甘油醚的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限（S／N＝3）Table 2 Regression equations，correlation coefficients（r2）and LODs（S／N＝3）for 6 target compounds

2.6 方法的回收率與精密度

在2 g空白的藠頭基質(zhì)中添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得藠頭樣品中雙酚－二環(huán)氧甘油醚的含量分別為5、10、20μg／kg。按上述方法每個加標(biāo)水平下平行測定6份樣品，連續(xù)6 d重復(fù)操作，最終結(jié)果見表3。6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚在空白藠頭中的平均添加回收率范圍為78.6%～89.9%，日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于10%；通過方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)該方法同樣適用于其他罐頭樣品的分析。

表3 藠頭樣品中6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚的添加回收率及精密度（n＝6）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations（RSDs）of 6 bisphenol diglycidyl ethers in a garlic sample（n＝6）

2.7 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用本方法測定市售不同品牌的罐頭食品的色譜圖見圖6。其中1份魚罐頭樣品中BADGE·H2O檢出量為3.02μg／kg；1份蓮子罐頭樣品中BADGE ·H2O·HCl檢出量為2.23μg／kg。

3 結(jié)論

通過對樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化和改進(jìn)，建立了測定食品接觸材料中6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚遷移量的MWCNTs－SPE－HPLC－MS／MS方法。方法簡單、快速、靈敏度高，測定結(jié)果可靠，以MWCNTs作SPE柱回收率更高，重現(xiàn)性更好，能滿足食品接觸材料中雙酚－二環(huán)氧甘油醚遷移量的分析要求，同時也為其他內(nèi)分泌干擾物的檢測提供了有利工具。

［1］ Pardo O，YusàV，León N，et al.J Chromatogr A，2006，1107（2）：70

圖6 實(shí)際樣品的MRM色譜圖Fig.6 MRM chromatograms of real samplesa.fish canned foodstuff；b.garlic canned foodstuff.

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