真菌營(yíng)養(yǎng)親和群鑒定方法的改進(jìn)

陳 強(qiáng),張金霞

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所,北京 100081)

真菌營(yíng)養(yǎng)親和現(xiàn)象反映的是同種群體內(nèi)個(gè)體的表型差異(或相似性)[1]。而真菌種內(nèi)擁有相同的異核體(heterokaryon,het)或營(yíng)養(yǎng)不親和(vegetative imcompatibility,vic)位點(diǎn)的個(gè)體(基因型)能夠融合形成異核體[2],能形成穩(wěn)定異核體的真菌個(gè)體被認(rèn)為屬于相同的營(yíng)養(yǎng)親種群(vegetative compatible group,VCG)。相反,存在一個(gè)或多個(gè)het或vic位點(diǎn)差異的個(gè)體不能融合,菌絲細(xì)胞接觸出現(xiàn)程序性死亡或凋亡的個(gè)體屬于不同的VCG[1,3]。某些真菌的菌絲分泌色素或顏色深,如葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)和Cryphonectriaceae科的多數(shù)種,菌絲不能融合,在不同的個(gè)體間能觀察到一條溝帶,對(duì)于這些種而言,在培養(yǎng)皿上測(cè)試它們的親緣關(guān)系,很容易確定它們的VCG,它可以為研究群體多樣性提供一個(gè)有力的視角[4-5]。對(duì)于菌絲的顏色淺的某些真菌,如鐮刀菌(Fusarium)中的種,屬于不同VCG的個(gè)體間的溝帶很難辨認(rèn),它們需要構(gòu)建nit突變體才能確定個(gè)體[6-7]。真菌VCG是研究物種起源、進(jìn)化和群體分化的一種有效手段。應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)不親和反應(yīng)可用來鑒定菌株,特別是在食用菌生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用比較廣泛,一般認(rèn)為：2個(gè)菌株對(duì)峙培養(yǎng),若發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不親和反應(yīng),則可以認(rèn)定它們?yōu)椴煌木?若它們營(yíng)養(yǎng)親和,則不能判定它們相同,需要采用其他方法進(jìn)一步鑒定。在日本的香菇、平菇、肺形側(cè)耳、杏鮑菇、毛木耳、金針菇、滑菇、黃傘、灰樹花、斑玉蕈、真姬菇、荷葉離褶傘、茶樹菇和磚紅離褶傘等14種食用菌新品種DUS(Distinctness、Uniformity、Stability,特異性、一致性、穩(wěn)定性)測(cè)試指南中,營(yíng)養(yǎng)不親和反應(yīng)均是測(cè)試項(xiàng)目之一。目前鑒定營(yíng)養(yǎng)親和群的方法通常是將群體內(nèi)的個(gè)體兩兩配對(duì),觀察個(gè)體的接觸區(qū)域是否產(chǎn)生溝帶或分泌色素,這個(gè)方法簡(jiǎn)單而且成本低,但是它的缺點(diǎn)就是工作量大,1個(gè)菌株要與群體中其他的每個(gè)菌株兩兩配對(duì),若有N個(gè)菌株,則需要的配對(duì)是C2N個(gè),當(dāng)N＞100時(shí),配對(duì)的組合數(shù)超過5 000,工作量非常大。本文改進(jìn)配對(duì)方法,減少配對(duì)的工作量,大大減少培養(yǎng)皿和培養(yǎng)基的使用量,節(jié)約材料和時(shí)間,提高配對(duì)效率。

1 材料與方法

1.1 材料的處理

以香菇Lentinula edodes為例,取7個(gè)菌株241、879、892、898、910、917、923,將它們分別接種PDA培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)活化。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取3個(gè)裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)。剪一個(gè)邊長(zhǎng)3 cm的正六邊形紙片,紙片中心留有小孔。把紙片蓋在培養(yǎng)皿底的外表面,用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿底上標(biāo)記正六邊形的頂點(diǎn)和中心。將菌株241、879、892、898、910、917、923按序號(hào)從小到大重新依次命名為A、B、C、D、E、F、G,按照?qǐng)D1的順序,取相同大小的菌種塊(直徑0.4 cm左右),分別接種于3個(gè)培養(yǎng)皿的相應(yīng)的位置,25℃培養(yǎng),培養(yǎng)皿正置。

圖1 供試菌株接種點(diǎn)示意圖Fig.1 Illustration of sites of tested strains inoculation

2 結(jié) 果

采用圖1的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),7個(gè)菌株兩兩間的配對(duì)接觸次數(shù)見表1。能夠保障每個(gè)菌株之間至少1次兩兩接觸,完全能夠正確反應(yīng)出7個(gè)菌株之間營(yíng)養(yǎng)不親和關(guān)系。實(shí)例證明(如圖2),采用3個(gè)培養(yǎng)皿就能判定7個(gè)菌株兩兩之間的營(yíng)養(yǎng)不親和性。

表1 供試菌株接觸次數(shù)Table 1 Pair times of tested strains

圖2 香菇7個(gè)菌株?duì)I養(yǎng)不親和反應(yīng)Fig.2 Vegetative compatible relations of sevenLentinula edodesstrains

3 討論與結(jié)論

采用本文設(shè)計(jì)的方法,在香菇、平菇、白靈菇鑒定營(yíng)養(yǎng)不親和試驗(yàn)中得到了滿意的效果,大大縮小了工作量。當(dāng)菌株比較多時(shí),可以將7個(gè)菌株為一組,分成若干組,同時(shí)從每組中取出1個(gè)菌株,組成新的一組(若菌株不夠7個(gè),可以將菌株重復(fù)若干次湊成7個(gè)),按照以上的方法分別判定組內(nèi)菌株的營(yíng)養(yǎng)親和關(guān)系。假設(shè)菌株的營(yíng)養(yǎng)親和關(guān)系是可以類推的,即菌株A分別與B、C親和,則推測(cè)B與C親和。將營(yíng)養(yǎng)親和群內(nèi)的菌株只保留1個(gè),與其他營(yíng)養(yǎng)親和關(guān)系未確定的菌株一起,按照以上的方法,繼續(xù)判斷,直到所有菌株的營(yíng)養(yǎng)親和關(guān)系明確為止。由于并非所有的營(yíng)養(yǎng)親和關(guān)系都能類推,在點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌(Suilus granulatus)中曾發(fā)現(xiàn)組織分離物VT1993與VT1990、VT1994營(yíng)養(yǎng)親和,而VT1990與VT1994營(yíng)養(yǎng)不親和[8]。但是這種現(xiàn)象很少見,仍可以假定營(yíng)養(yǎng)親和關(guān)系可以類推。對(duì)于推測(cè)營(yíng)養(yǎng)親和的菌株,再次配對(duì)即可驗(yàn)證。在運(yùn)用此方法時(shí),要掌握如下要點(diǎn)：若菌株生長(zhǎng)速度慢,則需要把培養(yǎng)基倒厚些;若有條件,可能用封口膜封口,以防培養(yǎng)基失水過多而影響結(jié)果;同一組的7個(gè)菌株,盡量挑選生長(zhǎng)速度相近的菌株,接種塊大小盡可能一致,以防生長(zhǎng)快的菌株侵占生長(zhǎng)慢的菌株的生長(zhǎng)空間,造成觀察不便;同一組的7個(gè)菌株實(shí)在是生長(zhǎng)速度差異比較大,則可以先接種生長(zhǎng)慢的菌株,隔一段時(shí)間接種生長(zhǎng)快的菌株。

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