下頜牽張成骨中應(yīng)用神經(jīng)生長因子對神經(jīng)損傷修復(fù)的作用

杜兆杰,雷德林,王 磊,曹 健,張雅博,張 圃,馬 秦,程曉兵

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科,陜西西安 710032)

牽張成骨技術(shù)(distraction osteogenesis,DO)又稱為“自體性骨組織工程”,是 20世紀(jì) 50年代由前蘇聯(lián)學(xué)者 Ilizarov[1]發(fā)展和完善并用于矯治各類四肢長骨畸形的一種方法,90年代后開始應(yīng)用于口腔頜面外科域[2],且發(fā)展迅速,已成為這一領(lǐng)域的研究熱點之一。下頜骨有特殊的解剖結(jié)構(gòu):下齒槽神經(jīng)(inferior alveolar nerve,IAN)位于骨性下頜管中,在牽張器植入、下頜骨牽引延長的過程中受到創(chuàng)傷和牽拉,這在一定程度上造成了 IAN的損傷[3-5]。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)是 1952年Levi.Montalcini最先在研究雞胚的神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的。NGF對神經(jīng)元的存活、生長發(fā)育、分化、再生和功能維持起調(diào)控作用。現(xiàn)已證實 NGF是參與損傷神經(jīng)再生和功能修復(fù)的重要因素,是兼有神經(jīng)營養(yǎng)因子與促神經(jīng)突起生長因子雙重作用的蛋白質(zhì)[6],全身應(yīng)用 NGF在治療中樞及外周神經(jīng)損傷中取得了明顯的效果,且已應(yīng)用于臨床[7-9]。很多研究證實,NGF及其受體在牽張成骨的過程中出現(xiàn)高表達(dá),而且與牽張應(yīng)力有著密切關(guān)系。隨著牽張應(yīng)力的消失,NGF及其受體的表達(dá)很快降低并恢復(fù)到正常水平[10-12],這提示神經(jīng)損傷在固定期的自我修復(fù)過程中,應(yīng)用外源性 NGF很可能會加快神經(jīng)修復(fù)。本研究組的既往研究發(fā)現(xiàn),DO中牽張區(qū)局部應(yīng)用 NGF能明顯促進(jìn) IAN的恢復(fù)[13],但全身注射NGF這種更安全的應(yīng)用方式,是否能促進(jìn)下齒槽神經(jīng)的修復(fù)仍未明確。因此在本實驗中,我們在牽張器植入后當(dāng)天給予全身注射 NGF,檢測兔 IAN的感覺神經(jīng)動作電位(sensory nerve action potential,SNAP),監(jiān)測牽張成骨術(shù)前及術(shù)后不同時期 IAN功能的變化,研究全身注射 NGF對下頜骨牽張成骨術(shù)中 IAN功能的影響。

材料與方法

1 實驗動物及分組

成年新西蘭白兔 52只,由本校實驗動物中心提供,雄性,口頜系統(tǒng)無異常,體重 2.8～3.2 kg,實驗前分籠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周,普通飲食。將兔隨機分為9組 ,Ⅰ組(空白組,4只)和 A組(肌注 NGF,牽張結(jié)束即刻組),B組(肌注 NGF,固定期 1周組),C組(肌注 NGF,固定期 2周組),D組(肌注 NGF,固定期 4周組),E組(肌注生理鹽水,牽張結(jié)束即刻組),F組(肌注生理鹽水,固定期 1周組),G組(肌注生理鹽水,固定期 2周組),H組(肌注生理鹽水,固定期 4周組),每組6只。除Ⅰ組未進(jìn)行任何干預(yù)外,其他 8組均行骨牽張術(shù)。

2 牽張器

所用的內(nèi)置式雙側(cè)下頜鈦牽張器由西安中邦鈦生物材料公司與本課題組共同研制(圖 1)。所應(yīng)用的因子是人胚胎提取的 NGF,由第四軍醫(yī)大學(xué)生化中心提供。

圖1 下齒槽神經(jīng)及牽張器

3 手術(shù)過程

兔術(shù)前 30分鐘肌注青霉素 30萬 U,給予肌注氯胺酮 50mg/kg,靜脈注入苯巴比妥鈉 40mg/kg,全麻成功后,頜下三角區(qū)備皮。取仰臥位固定四肢并常規(guī)消毒鋪巾后,向頜下三角區(qū)局部注射含有 1:200 000腎上腺素的 1%利多卡因 2.5ml。沿頜下三角正中切開皮膚和皮下約 3cm,顯露雙側(cè)下頜下緣,切開骨膜并沿其深面向頰側(cè)翻瓣,暴露并保護(hù)好頦神經(jīng),行牽張器植入。在截骨過程中,一直高度注意保護(hù)好下齒槽神經(jīng)血管束,而且完全固定牽張器后的骨斷端未見明顯移位,避免了下牙槽管斷端對IAN的刺激。創(chuàng)口反復(fù)沖洗后將骨膜復(fù)位縫合,分層嚴(yán)密縫合皮下和皮膚。將上前牙磨短至原牙冠的一半長,以減少將來下頜前徙時上切牙對下頜牙齦的刺激,以后每周調(diào)磨上前牙 1次。

4 術(shù)后處理

兔完全蘇醒后送回籠中,嚴(yán)密觀察并記錄其精神、飲食和體重情況。術(shù)后傷口每日清潔消毒并涂紅霉素軟膏 2次。術(shù)后 4天內(nèi)肌注青霉素,30萬U/12h。術(shù)后即分別給予肌注 NGF 0.6μg/d×20天和相當(dāng)量生理鹽水。經(jīng)過 4天的延遲期后,各組均按照 0.5mm/12h的速度連續(xù)牽張,總距離 10mm。

5 神經(jīng)電生理檢查

分別在牽張完成時,固定期 1、2、4周行 IAN和SNAP檢測。兔麻醉后取仰臥位,存在角膜反射,安靜不動,室溫 20～22℃,頜下三角區(qū)刮毛備皮。沿頜下三角正中切開皮膚和皮下約 3cm,顯露雙側(cè)下頜下緣,向頰側(cè)翻瓣,暴露并保護(hù)好頦神經(jīng)。取出牽張器,在下頜骨頰側(cè)頦孔區(qū)至下頜骨下緣沿 IAN的走行兩側(cè),渦輪機鉆頭開辟 2條平行溝槽,咬骨鉗輕輕去除頰側(cè)骨板,玻璃分針小心游離 IAN,期間持續(xù)滴石蠟油保持 IAN濕潤。用一直徑約為 3cm鋼圈與皮膚兩側(cè)切緣縫合形成油槽,以容納石蠟油,使IAN處于石蠟油環(huán)境中。頦孔端 IAN置雙極電極作刺激電極,下頜孔端置另一雙極電極作記錄電極并固定之。在刺激和記錄電極間置一針電極接地(圖2)。以細(xì)電壓單刺激的模式,刺激波形為方波,波寬0.5ms,延時 5.00ms,無疊加,起始刺激電壓為 1V,逐漸增加刺激強度直到引出最大穩(wěn)定動作電位。刺激偽跡到動作電位第 1個波峰為潛伏期,峰-基線值為波幅。每只兔的雙側(cè) IAN測量結(jié)果取平均值后進(jìn)行記錄。

圖2 油槽及電極的放置

結(jié) 果

在 48只接受手術(shù)的實驗兔中,有 3只(B、C、F組各 1只)在牽張期發(fā)生頜下區(qū)膿腫,后消瘦死亡,故被排除后續(xù)研究。其余 45只均耐受手術(shù)并保持健康狀態(tài)。在整個實驗過程中,健康兔的體重?fù)p失量都 ＜12%。實驗兔在手術(shù)后的前 2天內(nèi)僅對軟食感興趣,精神欠佳。而到第 3天,開始習(xí)慣牽張器,精神基本恢復(fù)到術(shù)前狀態(tài)并開始進(jìn)食普通干草飼料。牽張結(jié)束時,所有兔的下頜均明顯前凸。

SNAP檢測結(jié)果顯示,正常未進(jìn)行干預(yù)組(Ⅰ組)IAN波幅為 0.45mv,延遲期為 1.49ms。牽張結(jié)束時、固定期 1、2、4周時 NGF組的波幅均高于對照組;牽張結(jié)束時、固定期 1、2、4周時 NGF組的潛伏期均低于對照組(表 1,圖 3、4)。

應(yīng)用 SPSS10.0軟件包進(jìn)行 student t檢驗,分析NGF組與對照組之間波幅和潛伏期的差異。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。在牽張結(jié)束時、固定期 1周兩組之間的波幅和潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異,而固定期2、4周 NGF組的波幅和潛伏期均顯著高于對照組(P＜0.05)。表明,牽張成骨中下齒槽神經(jīng)在固定期 2、4周的神經(jīng)功能好于對照組。

表1 兩組波幅及潛伏期(±s)

表1 兩組波幅及潛伏期(±s)

分組 波幅(mv)NGF組 對照組P 潛伏期(ms)NGF組 對照組P牽張結(jié)束 0.20±0.045 0.17±0.036 0.5043 1.96±0.661 2.02±0.629 0.2522固定 1周組 0.27±0.031 0.24±0.044 0.0554 1.80±0.370 1.89±0.173 0.0723固定 2周組 0.31±0.018 0.26±0.025 0.0163 1.78±0.262 1.85±0.244 0.0358固定 4周組 0.37±0.066 0.31±0.034 0.0349 1.75±0.221 1.83±0.192 0.0305

圖3 NGF組 SNAP波形(橫箭頭為延遲期,縱箭頭為波幅)

圖4 對照組 SNAP波形(橫箭頭為延遲期,縱箭頭為波幅)

討 論

牽張成骨技術(shù)已經(jīng)成為一種治療下頜骨畸形或缺損的重要方法。NGF是 20世紀(jì) 50年初由 Levi.Montalcini在小鼠肉瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第 1個神經(jīng)營養(yǎng)因子,通常稱為 7sNGF。NGF對中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的生物效應(yīng)是維持和促進(jìn)交感神經(jīng)及來自神經(jīng)嵴的感覺神經(jīng)細(xì)胞的存活、分化、成熟以及發(fā)揮功能,是參與損傷神經(jīng)再生和功能修復(fù)的重要因素。有研究認(rèn)為未成熟的感覺神經(jīng)含有大量的 NGF受體,有 NGF依賴性,直接影響到它的發(fā)育和成熟。無論是局部注射或全身注射外源性的 NGF都能起到防止神經(jīng)切斷術(shù)后感覺神經(jīng)細(xì)胞的死亡。盡管成熟的感覺神經(jīng)已經(jīng)不及未成熟神經(jīng)依賴于 NGF,但仍然具有 NGF受體,而且能夠作為靶原型逆向營養(yǎng)因子影響上一級神經(jīng)元,表明 NGF在成熟的感覺神經(jīng)中依然起到很大的作用[14]。

很多研究已經(jīng)證實了局部應(yīng)用 NGF修復(fù)外周神經(jīng)(包括 IAN)的良好效果。同時 Eppley等[15]在應(yīng)用 NGF修復(fù)兔下牙槽神經(jīng)缺損時還發(fā)現(xiàn)再生的神經(jīng)軸突周圍有新生骨質(zhì)生成。研究表明,NGF可能通過如下 3種途徑促進(jìn)成骨:(1)誘導(dǎo)感覺和交感神經(jīng)纖維長入骨痂,感覺和交感神經(jīng)纖維在正常骨代謝和骨折愈合中發(fā)揮重要的作用,喪失這兩種神經(jīng)纖維支配的骨組織會表現(xiàn)為鈣化不良或骨質(zhì)疏松,而 NGF正是促進(jìn)這兩種神經(jīng)纖維發(fā)育和再生的主要因子之一[16];(2)直接促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化并抑制其凋亡[15];(3)促進(jìn)局部組織血管生成[17]。但是局部注射存在以下不足之處:局部注射勢必要對牽張區(qū)造成二次創(chuàng)傷,可能造成局部的物理損傷、炎癥、疼痛甚至引起感染等潛在的并發(fā)癥;局部注射的生長因子代謝快,能暫時形成有效的濃度,但是持續(xù)時間不長,雖然緩釋載體的應(yīng)用一定程度上維持了局部注射生長因子的作用時間,但是也存在材料的降解產(chǎn)物反應(yīng)等諸多問題。全身注射 NGF不僅能夠避免上述醫(yī)源性損傷的出現(xiàn),而且除了直接作用于牽張區(qū)外,還可能通過作用于中樞促進(jìn)外周神經(jīng)的恢復(fù),在體內(nèi)維持有效的作用時間。另外,全身注射 NGF還有方法簡便、不良反應(yīng)小的優(yōu)點,而且從心理上更容易被患者接受,可作為一種輔助治療手段,有廣泛的臨床應(yīng)用前景。近幾十年來國內(nèi)外對全身注射 NGF的作用機制和臨床應(yīng)用進(jìn)行了頗多研究,陳燕濤等[18]在對 48例周圍神經(jīng)損傷患者的治療中發(fā)現(xiàn),全身應(yīng)用 NGF對周圍神經(jīng)損傷的恢復(fù)有顯著的促進(jìn)作用,同時患者疼痛和乏力癥狀的改善要明顯優(yōu)于對照組。韓汝政等[19]用NGF治療顱神經(jīng)損傷 70例(肌內(nèi)注射 NGF)與對照組(常規(guī)支持療法)相比,痊愈率、有效率均高于對照組,并能顯著縮短病程,早期應(yīng)用更佳。張素愛等[20]全身應(yīng)用 NGF對 98例面神經(jīng)炎的患者進(jìn)行治療,結(jié)果顯示 NGF對面神經(jīng)功能的恢復(fù)在早期即具有促進(jìn)作用,且隨療程延長,療效進(jìn)一步增加,NGF配合常規(guī)治療明顯縮短面神經(jīng)炎病程,改善預(yù)后,并具有不良反應(yīng)少等優(yōu)點。Santos等[21]在全身應(yīng)用 NGF對大鼠燒傷的研究中,證實 NGF不僅能防止外周神經(jīng)元的死亡而且還能降低血管通透性和血液黏稠度。綜上所述,全身應(yīng)用 NGF對中樞神經(jīng)、外周神經(jīng)、運動神經(jīng)或是感覺神經(jīng)損傷的修復(fù)都有顯著的促進(jìn)作用,而且能不同程度減輕患者的痛苦。

下齒槽神經(jīng)走行于狹窄的骨性下頜管,下頜骨截骨、牽張器安裝、骨斷端的移位以及對神經(jīng)的拉伸都有可能對 IAN產(chǎn)生直接的損傷[4]。牽張成骨中,由于截骨術(shù)后組織滲出、組織的低氧、牽張過程中對周圍軟組織的延長勢必導(dǎo)致牽張區(qū)壓力的大大增加,動靜脈回流受阻,從而對 IAN造成間接的損傷,類似于正中神經(jīng)的“腕管綜合征”[22]。然而下頜骨的牽張是造成 IAN損傷的最主要因素,牽張中不僅要延長下頜骨及其周圍肌肉等軟組織,重要的是在牽張的同時對 IAN也進(jìn)行了延長,雖然 IAN有一定的可塑性,但是依然會造成 IAN的損傷甚至是不可逆的損傷。Rostcam等[23]認(rèn)為牽張成骨是造成 IAN損傷的機械因素,即使以 0.5mm/12h的速度牽張仍然會導(dǎo)致 IAN的損傷。為了能促進(jìn) IAN的修復(fù)及下頜骨的成骨并縮短 DO周期,NGF作為經(jīng)典的促神經(jīng)修復(fù)因子,其固有的修復(fù) IAN和促進(jìn)成骨作用愈加受到重視。

牽張過程中對 IAN的延長導(dǎo)致的髓鞘崩解和巨噬細(xì)胞的入侵,牽張區(qū)的各種內(nèi)源性因子表達(dá)明顯增高,隨著牽張結(jié)束這些因子逐漸恢復(fù)到正常水平[11]。因此,外源性因子的最佳干預(yù)時機應(yīng)該選在牽張成骨的固定期。但是同時參考臨床上治療外周神經(jīng)損傷的時機、方法、劑量及療程[18-20],為了充分的發(fā)揮 NGF的作用,我們在牽張器植入術(shù)后立即給予肌注 NGF,每日 1次,直到固定期 1周結(jié)束。

近兩個世紀(jì),神經(jīng)電生理的方法檢測下牙槽神經(jīng)的功能,在臨床和實驗中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用,神經(jīng)電生理的方法無論在敏感性還是特異性上有著獨到的優(yōu)勢[4,24]。近年來大量文獻(xiàn)證實,用誘發(fā)神經(jīng)動作電位的方法能很好的檢測在牽張成骨中各個時期神經(jīng)的受損情況[4]。本實驗采用 BL-420F生物功能實驗系統(tǒng)及檢測設(shè)備誘發(fā)并記錄 IAN的SNAP,波形穩(wěn)定,重復(fù)性好,結(jié)果可靠。在 SNAP檢測中,波幅降低說明有一定數(shù)量的神經(jīng)纖維斷裂、軸突缺失;潛伏期延長則說明有節(jié)段性軸突脫髓鞘變,神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度降低,由此可反映神經(jīng)的功能。實驗中我們采取完全解剖游離 IAN的方法,排除了周圍組織對檢測結(jié)果的影響,能充分反映 IAN的功能。我們發(fā)現(xiàn),在牽張結(jié)束時、固定期 1周,雖然全身注射 NGF組 IAN的 SNAP波幅高于對照組,延遲期低于對照組,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。而固定期2、4周全身注射 NGF組 IAN的 SNAP波幅明顯高于對照組,延遲期明顯低于對照組(P＜0.05),在統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異,與王曉霞等[3]、Makarov等[4,5]的研究相符。數(shù)據(jù)表明,在牽張結(jié)束時及固定期 1周,可能由于牽張應(yīng)力等因素誘發(fā)的內(nèi)源性 NGF及其受體明顯表達(dá)增高,雖然牽張完成應(yīng)力消失,但是牽張區(qū)的內(nèi)源性因子還會保持一定的水平,因此此期間外源性 NGF對 IAN損傷的修復(fù)作用并不明顯。而到固定期 2周后隨著刺激因素消失和代謝作用,內(nèi)源性的 NGF表達(dá)顯著降低,全身注射 NGF能維持外源性 NGF在體內(nèi)的濃度,持續(xù)發(fā)揮修復(fù) IAN損傷的作用。

總之,全身注射神經(jīng)生長因子有利于牽張成骨中下齒槽神經(jīng)功能的恢復(fù),這有望為臨床上減少DO治療的神經(jīng)并發(fā)癥提供一種有效的方法。

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