櫛孔扇貝D形幼蟲血細胞發(fā)生特點的研究*

李子牛,邢 婧,林聽聽,戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003)

櫛孔扇貝D形幼蟲血細胞發(fā)生特點的研究*

李子牛,邢 婧,林聽聽,戰(zhàn)文斌**

(中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003)

研究組前期實驗表明,櫛孔扇貝(Chlamys f arreri)從囊胚期開始的各發(fā)育時期中,以D形幼蟲期開始出現(xiàn)形態(tài)可辨的血細胞。本文采用石蠟切片、組織化學、櫛孔扇貝血細胞單克隆抗體的免疫組化方法,定位、觀察櫛孔扇貝D形幼蟲血細胞的分布和形態(tài)特點。結(jié)果表明:可辨形態(tài)的血細胞集中分布于幼蟲的外套膜、面盤、口、食道、胃、消化腺、腸等組織,游離的血細胞大多為球形或橢球形,直徑約為1～3μm,中央有一深色細胞核,而在消化腺中血細胞密集層疊,形態(tài)各異。在該時期未觀察到不同類型的血細胞和造血組織。結(jié)論認為,D形幼蟲期開始出現(xiàn)形態(tài)可辨的血細胞,主要分布于與攝食消化相關(guān)的組織器官內(nèi)。

櫛孔扇貝;D形幼蟲;血細胞;單克隆抗體

貝類不具有特異性免疫,對宿主免疫防御主要是通過血細胞為主的細胞免疫反應輔以體液因子參與的體液免疫反應清除外來病原和異物,因此,血細胞在貝類免疫防御機制中起著重要作用[1]。血細胞在貝類全身各處循環(huán)分布,行使吞噬、創(chuàng)傷修復、營養(yǎng)等功能,并通過分泌各種非特異性體液因子完成宿主的免疫防御反應[2,3],但是貝類血細胞不能進行有絲分裂,其補充和更新主要依靠造血組織完成[4]。有關(guān)貝類血細胞的形態(tài)、分類、細胞化學、體液因子活性、免疫功能等的研究已有諸多報道[5-9],但關(guān)于貝類血細胞發(fā)生和發(fā)育的研究相對較少。Dyrynda等應用單克隆抗體對貽貝(Mytilus edulis)胚胎幼體的血細胞研究中發(fā)現(xiàn),在第1～4 d和第11 d的幼蟲與抗體反應并呈強陽性,但并沒有詳細的形態(tài)描述[10]。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝(Chlamys f arreni)稚貝的造血組織定位在閉殼肌附近[11]。最近采樣櫛孔扇貝從受精卵開始的各發(fā)育時期的幼蟲,通過抗櫛孔扇貝單克隆抗體跟蹤定位血細胞的發(fā)生發(fā)育情況(另文發(fā)表),發(fā)現(xiàn)在D形幼蟲期開始出現(xiàn)形態(tài)可辨的血細胞。本文采用石蠟切片、組織化學法、櫛孔扇貝血細胞單克隆抗體的免疫組化方法,定位、觀察櫛孔扇貝D形幼蟲血細胞的分布和形態(tài)特點等,以期為研究和闡明扇貝血細胞的發(fā)生、分化和成熟過程提供資料。

圖1 抗櫛孔扇貝血細胞單克隆抗體2C6的免疫細胞化學結(jié)果Fig.1 Haemocytes ofC.f arrerirecognized by Mab 2C6 using immunohistochemical staining

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

櫛孔扇貝(C.f arreri)D形幼蟲樣品采集于文登市水產(chǎn)綜合育苗試驗基地,為孵化后第1～4 d幼蟲,鏡檢其幼蟲全長約為(140±10)μm。

鼠抗櫛孔扇貝血細胞的單克隆抗體2C6由中國海洋大學免疫與病害實驗室制備[12],經(jīng)免疫細胞化學法、流式細胞儀和Western-blotting分析其特性,證明這株單克隆抗體具有抗櫛孔扇貝血細胞的特異性,抗櫛孔扇貝血細胞單克隆抗體的免疫細胞化學結(jié)果見圖1。

生物素化馬抗小鼠IgG(H+L)、堿性磷酸酶(AP)標記鏈親和素、堿性磷酸酶底物AP-Red試劑盒(sigma公司)購自北京中杉金橋生物公司,牛血清白蛋白(BSA)購自AMRESCO公司,3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)購自sigma公司。

1.2 方法

幼蟲樣品的處理 幼蟲放入Bouin’s液中固定12 h后移入70%酒精中保存。固定后幼體以500目篩絹包裹脫水透明,以石蠟包埋。

組織切片 將石蠟包埋的扇貝D形幼蟲連續(xù)切片厚度5μm。將玻片置于烘箱中37℃過夜,二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水后晾干切片表面水分,放入-20℃冰箱中備用。切片所用的載玻片預先用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)處理。

H&E染色 取出一部分石蠟切片進行蘇木精-曙紅染色,梯度乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹膠封片,O-lympus顯微鏡觀察,拍照。

免疫組化 取出一部分石蠟切片,加3%醋酸,室溫孵育10 min,以阻斷扇貝組織內(nèi)源酶的活性,然后用含0.1%tween-20的0.01 mol磷酸鹽緩沖液(PBST,p H=7.4)浸洗5 min。將切片放入p H=6.0檸檬酸緩沖液中,在120℃的高壓鍋中放置7 min進行抗原修復,取出后用PBST浸洗5 min;加3%的牛血清白蛋白孵育30 min封閉;PBST浸洗3次,每次5 min;加第一抗體-鼠抗櫛孔扇貝血細胞的單克隆抗體2C6,37℃孵育1 h,PBST浸洗3次,每次5 min;之后,加生物素化馬抗小鼠IgG(稀釋比例1∶2 000),37℃孵育45 min,PBST浸洗3次,每次5 min;然后加堿性磷酸酶(AP)標記鏈親和素(稀釋比例1∶500),37℃孵育45 min,PBST浸洗3次,每次5 min。最后,以堿性磷酸酶底物AP-Red試劑盒底物發(fā)色5 min,自來水沖洗,蘇木素復染1 min,0.1%的HCl分色,自來水沖洗,藍化,50%緩沖甘油封片,Olympus顯微鏡觀察,拍照。陰性對照用骨髓瘤細胞(P3U1)培養(yǎng)液上清代替抗櫛孔扇貝血細胞單克隆抗體為第一抗體。

2 結(jié)果

2.1 光鏡和組織化學觀察

在光鏡下觀察,櫛孔扇貝D形幼蟲呈黃褐色,體外覆蓋1層薄的殼,殼長約為(140±10)μm,殼呈“D”字形,貝殼透明,可見殼內(nèi)中央部位的內(nèi)臟團(見圖2A小圖版)。幼蟲貝殼張開時可見橢圓形的面盤伸出,面盤周圍上生長許多纖毛,使其能在水中游動和攝食,面盤也可收縮于殼內(nèi)。在幼蟲內(nèi)臟團中央為胃,其內(nèi)可見吞食的綠色藻類,內(nèi)臟團背后方有足(見圖2A)。

石蠟切片經(jīng)H&E染色后觀察發(fā)現(xiàn),櫛孔扇貝D形幼蟲已經(jīng)開始具有分化清晰的組織器官。包括:外套膜、面盤、口、食道、胃、腸、足。幼蟲蟲體被1層薄的外套膜包裹,面盤收縮于外套膜內(nèi),面盤表面長有1層纖毛,面盤一側(cè)有口,口周圍也附有纖毛,口與幼體的食道連接至膨大的胃部,食道周圍附有膨大的消化腺,胃之后緊接腸道以及肛門。在面盤的下部,消化腺的左側(cè)有足(見圖2B)。H&E染色仍能看見胃中的食物。幼體食道、消化腺、胃等處均有大量細胞聚集,H&E染色為深藍色,形態(tài)類似血細胞。在外套膜、口、食道和胃邊緣處分布的血細胞呈游離狀,血細胞呈球形或橢球形,直徑約為1～3μm,屬于外周循環(huán)血細胞。在消化腺中,血細胞高度密集形態(tài)各異,成簇分布,可能與幼蟲旺盛的捕食、消化功能相適應。

2.2 免疫組化觀察

石蠟切片經(jīng)單克隆抗體的免疫組化實驗后,陽性信號(紅色的沉淀)出現(xiàn)在幼體組織和細胞的內(nèi)部,說明D形幼蟲體內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)了大量血細胞。陽性信號分散地出現(xiàn)于幼蟲的外套膜邊緣帆狀部分,面盤的纖毛根部,胃和食道壁的上皮組織內(nèi),說明在外套膜邊緣面盤和消化道壁內(nèi)的上皮組織內(nèi)均勻地分布著游離的血細胞(見圖2C)。血細胞為球形或橢球形,直徑約為1～3μm,中央有一深色細胞核。消化腺中由于血細胞成簇存在,大量聚集,陽性信號密度高且呈簇出現(xiàn)。無法清晰地觀察到血細胞的內(nèi)部形態(tài)(見圖2C放大圖版)。陰性對照顯示無任何陽性信號出現(xiàn)(見圖2D)。

圖2 櫛孔扇見D形幼蟲形態(tài)及血細胞分布Fig.2 The morphology and haemocyte localization of D lovivae inC.f arreni

3 討論

本文通過光鏡觀察、H&E染色、單克隆抗體的免疫組化方法研究櫛孔扇貝D形幼蟲體內(nèi)血細胞的分布特點,結(jié)果顯示,D形幼蟲體內(nèi)出現(xiàn)形態(tài)分化的組織器官,包括外套膜、面盤、口、胃、食道、消化腺、腸、足等。血細胞分布于幼蟲的外套膜、面盤、口、胃、食道等的上皮組織內(nèi),血細胞呈游離狀態(tài)分布,為球形或橢球形,直徑約為1～3μm,中央有一深色細胞核。另外,血細胞在消化腺內(nèi)大量聚集,免疫組化結(jié)果呈強陽性。

本研究組在前期研究過程中,采集了櫛孔扇貝各個發(fā)育時期的樣品,包括:囊胚期、原腸期、擔輪幼蟲、D形幼蟲、殼頂幼蟲、稚貝,對樣品進行前期的實驗研究發(fā)現(xiàn)在原腸期、單輪幼蟲時期均出現(xiàn)了陽性信號(另文發(fā)表),但因為這些時期幼蟲的組織細胞并沒有完全分化,單抗反應呈陽性的細胞與其周圍的細胞區(qū)分不開,不能夠分辨細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。然而從D形幼蟲開始組織器官明顯分化[13],出現(xiàn)了分化出的胃、食道、消化腺、腸、足等組織,游離狀態(tài)的血細胞可見于該組織中。免疫組化的陽性信號(紅色)也開始增強增多,在消化腺、食道等處出現(xiàn)呈團聚集和游離的血細胞。Dyrynda等的研究結(jié)果表明,抗貽貝(M.edulis)血細胞的單克隆抗體與1～4 d的幼反應,出現(xiàn)了陽性信號,本文這一結(jié)果與Dyrynda等的結(jié)果一致[10]。D形幼蟲的組織器官有了明顯分化,行使不同的功能,需要有循環(huán)的血細胞傳遞和轉(zhuǎn)運營養(yǎng)物質(zhì),行使免疫防御等功能。在D形幼蟲中,血細胞發(fā)揮著重要的作用,因此,本研究選取D形時期的幼蟲為研究對象,對其血細胞發(fā)生的形態(tài)和抗原特點進行研究。

通常在免疫組化實驗中,為了保存抗原性大多使用冰凍切片方法,但該方法不能很好的還原樣品的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。本文采用石蠟切片,經(jīng)高壓方法進行抗原修復,保證了樣品抗原性的恢復,再進行免疫組化,結(jié)果表明,該方法使樣品保持了較完整的形態(tài)和抗原性,該方法為扇貝血細胞發(fā)生發(fā)育的研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

在本研究前期實驗中,選取了本研究組研制的單克隆抗體1E7、1F12、2C6、2H5這4株抗櫛孔扇貝血細胞單克隆抗體定位觀察扇貝幼蟲血細胞,研究結(jié)果表明不同抗體出現(xiàn)陽性信號的時期不同,大部分單克隆抗體都在D形幼蟲期才出現(xiàn)陽性信號,且陽性信號較弱。只有單抗2C6在原腸期起出現(xiàn)陽性信號,并隨著幼蟲的發(fā)育而陽性型號增強增多。究其原因,可能在櫛孔扇貝早期發(fā)育時期還未出現(xiàn)與1E7、1F12、2H5這3株抗體相關(guān)的血細胞的抗原決定簇,抑或血細胞還沒有完全分化成熟,這3株單克隆抗體還不能夠與之結(jié)合。此外,在成體扇貝中,觀察到的血細胞大多為游離狀態(tài),分布于外套膜、閉殼肌、鰓、消化腺、胃、腸,等組織器官內(nèi),在造血組織內(nèi),血細胞高度聚集,層疊增生,通過管道與閉殼肌相連輸送成熟的血細胞入圍心腔。在D形幼蟲期,部分血細胞游離分布于幼蟲的外套膜邊緣帆狀部分,面盤的纖毛根部,胃和食道壁的上皮組織內(nèi),或者聚集于消化腺中,以上器官或組織都與扇貝的攝食、消化功能相關(guān)。而在成體扇貝中,血細胞分化為顆?；蛲该骷毎?并通過吞噬、胞吐、聚集、營養(yǎng)、運輸?shù)茸饔脜⑴c免疫防御、攝食消化等,比D形幼蟲的血細胞所發(fā)揮的功能要強大得多?？梢?D形幼蟲時期的血細胞還未進行更為專業(yè)的分化,至于D形幼蟲血細胞中分化出顆粒細胞和透明細胞,本研究組將通過不同類型血細胞的單克隆抗體定位不同時期幼蟲的血細胞進行深入研究。

根據(jù)文獻報道,櫛孔扇貝的稚貝和成貝,有3個大型的靜脈竇,第1個靜脈竇位于消化腺和圍心腔膜的下面,與兩側(cè)的左右腎相通;其余2個靜脈竇位于閉殼肌腹緣的左右側(cè),閉殼肌側(cè)的囊狀組織為其血細胞的發(fā)生器官[4]。本文研究發(fā)現(xiàn):幼蟲的循環(huán)系統(tǒng)為開放式,成形的血細胞存在于D形幼蟲的與攝食消化相關(guān)的組織器官(外套膜、面盤、口、食道、胃、腸、消化腺)中,這可能與血細胞具有運輸和消化營養(yǎng)物質(zhì)的功能有關(guān)。陳蜀娜等[14]在河蚌(Hyriopsis cumingii)外套膜鈣的組織化學定位及運輸途徑的研究中以及胡曦璇等[15]在背角無齒蚌(A nodonta woodiana)珍珠囊形成過程中鈣代謝的研究中都發(fā)現(xiàn)血細胞具有運輸Ca2+的能力。但本文并未發(fā)現(xiàn)像稚貝或成體扇貝高度集中的造血組織或血細胞發(fā)生組織。可能造血組織還沒有完全分化出來或者已經(jīng)包埋于消化腺等組織器官之中,有待進一步研究。

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Localization and Distribution of Haemocytes in D Larvae of Scallop Chlamys farreri

LI Zi-Niu,XIN GJing,LING Ting-Ting,ZHAN Wen-Bin
(The Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Preliminary data showed that,during the development of Chinese scallopChlamys f arreri,distinguishable haemocytes occurred since the stage of D larvae.In this paper,the study on the distribution and morpha of haemocytes in D larvae were carried out by the methods of light microscopy,histochemical staining and immunohistochemistry(IHC)with monoclonal antibodies against haemocytes ofC.f arreri.The results showed that the haemocytes with distinguishable morpha were mainly distributed in the tissues of mantle,velum,mouth,esophagus,stomach,digestive gland and intestine.Moreover,the dissociative haemocytes with a fuscous nuclear in center were spherical or spheroidical,with a diameter of 1～3μm,and assembled in digestive gland.However,the different types of haemocytes and the hematopoietic tissues were not found in D larvae stage.So,as a conclussion,we deduced that the haemocytes became morphologically distinguishable from D larvae stage and mainly distributed in tissues and organs which are related to feeding and digestion.

Chlamys f arreri;D larvae;haemocyte;monoclonal antibody

S917

A

1672-5174(2010)09-061-05

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2006AA100307);國家自然科學基金項目(30901112)資助

2009-11-09;

2010-04-27

李子牛(1985-),男,碩士生,主要從貝類免疫學研究.E-mail:ironbullan@yahoo.com.cn

**通訊作者:Tel:0532-82032284;E-mail:wbzhan@ouc.edu.cn

責任編輯 于 衛(wèi)