耐力運(yùn)動(dòng)對ApoE基因敲除小鼠一氧化氮系統(tǒng)的影響及其對AS形成的干預(yù)作用

張洪俠2，劉善云李寧馮紅王洪濤王敏徐新女，王金環(huán)

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耐力運(yùn)動(dòng)對ApoE基因敲除小鼠一氧化氮系統(tǒng)的影響及其對AS形成的干預(yù)作用

張洪俠1，2，劉善云1，李寧1，馮紅1，王洪濤1，王敏1，徐新女3，王金環(huán)3

目的：以ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠為動(dòng)脈粥樣硬化（AS）模型，觀察耐力訓(xùn)練對ApoE-/-小鼠AS形成的干預(yù)作用及NO系統(tǒng)的影響，以探討耐力運(yùn)動(dòng)抗AS的可能機(jī)制。方法：將24只8周齡ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為AS模型組和運(yùn)動(dòng)干預(yù)組，每組12只，運(yùn)動(dòng)組在活動(dòng)跑臺上進(jìn)行耐力訓(xùn)練，實(shí)驗(yàn)持續(xù)14周后，測定兩組小鼠主動(dòng)脈斑塊面積及病理變化、血清NO和血脂水平以及主動(dòng)脈iNOS和eNOS蛋白表達(dá)。結(jié)果：運(yùn)動(dòng)組小鼠主動(dòng)脈斑塊面積顯著小于對照組（P＜0.01），血管壁及內(nèi)膜損傷程度較對照組減輕，血清NO濃度和主動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)顯著高于對照組（P＜0.01），i-NOS蛋白表達(dá)顯著低于對照組（P＜0.05），血脂水平兩組間無顯著差異。結(jié)論：耐力運(yùn)動(dòng)通過增加eNOS蛋白表達(dá)、抑制iNOS蛋白表達(dá)和提高血中NO水平而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

耐力運(yùn)動(dòng)；ApoE基因敲除小鼠；動(dòng)脈粥樣硬化；一氧化氮；一氧化氮合酶

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。一般認(rèn)為，AS的發(fā)生發(fā)展是多種遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。近年研究顯示，AS是血管內(nèi)皮損傷后的一種慢性炎癥反應(yīng)過程，而一氧化氮（NO）功能低下與血管內(nèi)皮損傷及慢性炎癥反應(yīng)有著密切的關(guān)系[1]，因而成為AS發(fā)病機(jī)制中一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。許多研究表明，NO合成不足或其利用率降低與AS的形成、發(fā)展及其并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。

運(yùn)動(dòng)鍛煉是防治動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的有效措施。已有研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)能有效地調(diào)節(jié)NO合成及一氧化氮合酶（NOS）的表達(dá)、增強(qiáng)NOS活性等[3-6]，提示運(yùn)動(dòng)通過改善NO/NOS系統(tǒng)機(jī)能而對動(dòng)脈粥樣硬化防治產(chǎn)生有益的影響。本研究以ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠為研究對象，在復(fù)制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AS模型的基礎(chǔ)上，深入探討耐力運(yùn)動(dòng)對ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的干預(yù)效果及對機(jī)體NO/NOS系統(tǒng)的影響，以闡明耐力運(yùn)動(dòng)對動(dòng)脈粥樣硬化影響的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)

選取8周齡ApoE-/-小鼠24只，雄性，體重20～22 g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼以“西方類型”膳食（膽固醇0．15%，脂肪21%），二級條件飼養(yǎng)。將各組小鼠分別在層流架中分籠飼養(yǎng)，每籠3～5只，自由進(jìn)食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度保持在22～24℃，相對濕度為50%，光照時(shí)間12 h/天。

1.2 動(dòng)物分組及訓(xùn)練方案

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為AS模型組（安靜對照組）和運(yùn)動(dòng)組，每組12只。運(yùn)動(dòng)組在活動(dòng)跑臺上適應(yīng)性訓(xùn)練一周后，于每日上午9～10時(shí)進(jìn)行耐力訓(xùn)練，依據(jù)加拿大學(xué)者Fernando等[7]的研究資料，確定小鼠運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度范圍，跑臺速度為13 m/m in，5天/周，1 h/天。實(shí)驗(yàn)持續(xù)14周。

1.3 取材及組織處理

實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束將所有小鼠處死，禁食過夜（運(yùn)動(dòng)組停止運(yùn)動(dòng)24 h，以消除最后一次運(yùn)動(dòng)的急性效果）。采取眼球摘除法取血，離心分離血清，置-20℃保存。取血后迅速打開胸腔，暴露心臟和主動(dòng)脈，從心尖部用注射器注入DEPC水進(jìn)行沖洗，剪開右心耳以便流出沖洗液，慢速注入。取出全心臟（包括主動(dòng)脈弓），以制備主動(dòng)脈冰凍切片。

1.4 各指標(biāo)測定與方法

1.4.1 血脂的測定甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）采用酶比色法測定；高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）采用沉淀法測定。血脂測試試劑盒購自北京中生生物工程公司。

1.4.2 血清一氧化氮的測定采用硝酸還原酶法測定一氧化氮（NO）。使用722分光光度計(jì)，在550nm波長處測定樣品反應(yīng)后的吸光度，計(jì)算NO含量。NO測試試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司；一氧化氮合酶（iNOS、eNOS）抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.4.3 主動(dòng)脈斑塊面積評估（油紅O染色）及組織形態(tài)學(xué)觀察（HE染色）主動(dòng)脈根部冰凍切片的制作：取出小鼠心臟連同主動(dòng)脈，剝離血管外附著組織進(jìn)行固定后用O．C．T包埋，連續(xù)切片，切片厚度7μm/張，在顯微鏡下選擇切片，選取主動(dòng)脈橫斷面出現(xiàn)三個(gè)主動(dòng)脈瓣膜時(shí)起至瓣膜消失。每間隔10張取一張，共5張參與斑塊面積評估，采用油紅O染色，利用計(jì)算機(jī)圖像分析Leica Qwin V3系統(tǒng)對主動(dòng)脈斑塊面積進(jìn)行估算，參照Suzuki等[8]方法，主動(dòng)脈斑塊以斑塊面積/管腔總面積的比值來表示。另取12張切片進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察主動(dòng)脈病理變化。

1.4.4 主動(dòng)脈iNOS、eNOS蛋白表達(dá)的檢測主動(dòng)脈iNOS、eNOS蛋白表達(dá)采用免疫組化PV法進(jìn)行測定，表達(dá)強(qiáng)度用組織學(xué)評分表示。每組切片隨機(jī)選取5個(gè)視野（400×），計(jì)數(shù)陽性染色細(xì)胞所占視野內(nèi)總細(xì)胞百分比作為iNOS、eNOS的表達(dá)強(qiáng)度。棕黃色顆粒為目的蛋白表達(dá)陽性著色部位，藍(lán)色為蘇木素復(fù)染細(xì)胞核著色，陽性部位主要在胞槳。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由SPSS統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS11．5）處理，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用獨(dú)立T檢驗(yàn)，顯著性水平為0．05和0．01。

2 結(jié)果

2.1 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊面積的變化

8周齡ApoE-/-小鼠經(jīng)14周“西方類型”膳食飼養(yǎng)至22周齡時(shí)，主動(dòng)脈切片經(jīng)油紅O染色在顯微鏡下觀察可見，AS模型組和運(yùn)動(dòng)組小鼠主動(dòng)脈均有不同程度的被染成紅色的脂質(zhì)斑塊。與模型組相比，運(yùn)動(dòng)組小鼠主動(dòng)脈斑塊面積顯著低于模型組（P＜0．01），見表1、圖1。表明在本實(shí)驗(yàn)中耐力運(yùn)動(dòng)延緩了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

表1 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊面積（）Table 1 The square ofaorta plaque in ApoE-deficientm ice（）

表1 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊面積（）Table 1 The square ofaorta plaque in ApoE-deficientm ice（）

注：**與模型組相比P＜0.01（下同）。

/只斑塊面積/μm2管腔總面積/μm2斑塊面積/管腔總面積/%模型組12 288 267.00±組別樣本數(shù)68 654.61 691 238.70± 128 603.31 41.79±6.93運(yùn)動(dòng)組12 131 678.90± 39 061.29 467 816.60± 132 568.37 25.07±7.04**

2.2 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)變化

22周齡ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈冰凍切片經(jīng)HE染色顯微鏡下觀察顯示，AS模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，可見大量泡沫細(xì)胞形成的脂紋期病變和纖維期病變，并有炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)果提示，模型組小鼠已發(fā)生明顯的AS病變。與AS模型組相比，運(yùn)動(dòng)組小鼠主動(dòng)脈病變相對較輕，多為脂紋期病變。提示，耐力運(yùn)動(dòng)能有效地抑制或減輕ApoE-/-小鼠AS病變程度。

圖1 兩組小鼠主動(dòng)脈冰凍切片油紅O染色的比較（放大倍數(shù)：40、100倍）Figu re 1 The com parison ofaortic change w ith OilRed O staining using frozen section between m ice of two groups

2.3 ApoE-/-小鼠血脂的變化

由表2可見，經(jīng)14周耐力運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，血清TC、TG、HDLC和LDL-C等指標(biāo)兩組間均無顯著性差異。提示耐力運(yùn)動(dòng)對ApoE-/-小鼠血脂水平未產(chǎn)生明顯影響。

表2 ApoE-/-小鼠血脂的變化（）Table 2 The change ofblood lipid in ApoE-deficientm ice（）

表2 ApoE-/-小鼠血脂的變化（）Table 2 The change ofblood lipid in ApoE-deficientm ice（）

HDL-C /mmo·/L-1模型組10 16.79±3.73 1.51±0.30 15.12±2.82 0.98±0.29運(yùn)動(dòng)組10 16.87±3.89 1.25±0.25 15.49±3.64 0.79±0.20組別樣本數(shù)TC/mmol·L-1 TG/mmol·L-1 LDL-C /mmol·L-1

2.4 ApoE-/-小鼠血清NO的變化

由表3可見，經(jīng)14周耐力運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，運(yùn)動(dòng)組小鼠血清NO水平顯著高于模型組（P＜0．05）。提示運(yùn)動(dòng)可以改善血管內(nèi)皮功能，提高NO水平。

表3 ApoE-/-小鼠血清NO的變化（）Table 3 The change ofserum NO in ApoE-deficientm ice（）

表3 ApoE-/-小鼠血清NO的變化（）Table 3 The change ofserum NO in ApoE-deficientm ice（）

注：*與模型組相比P＜0.05。

組別樣本數(shù)/只血清NO/μm·L-1模型組10 53.39±5.87運(yùn)動(dòng)組10 63．79±7．58*

2.5 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈iNOS、eNOS蛋白表達(dá)的變化

經(jīng)14周耐力運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，運(yùn)動(dòng)組小鼠主動(dòng)脈iNOS蛋白表達(dá)顯著低于模型組（P＜0．01）；而eNOS蛋白表達(dá)顯著高于模型組（P＜0．01），見表4、圖2、圖3。

表4 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈iNOS和eNOS蛋白表達(dá)（）Table 4 The protein expression ofaortic iNOS and eNOS in ApoE-deficientmice（）

表4 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈iNOS和eNOS蛋白表達(dá)（）Table 4 The protein expression ofaortic iNOS and eNOS in ApoE-deficientmice（）

組別樣本數(shù)/只iNOS/%eNOS/%模型組12 48.29±2.33 34.93±7.63運(yùn)動(dòng)組12 27.98±3.25**56．98±6．84**

圖2 兩組小鼠主動(dòng)脈iNOS蛋白表達(dá)的比較Figure 2 The com parison of protein exp ression ofaortic iNOS betweenmice of two groups

圖3 兩組小鼠主動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)的比較Figure 3 The com parison of protein exp ression ofaortic eNOS betweenm ice of two groups

3 討論

近年來，有關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化干預(yù)手段及其機(jī)制的研究日益受到關(guān)注。本研究對運(yùn)動(dòng)干預(yù)ApoE基因敲除小鼠AS形成及作用機(jī)制方面進(jìn)行了深入探索，并獲得了一些有益的結(jié)果。

3.1 耐力運(yùn)動(dòng)對ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊面積及病理變化的影響

采用基因敲除技術(shù)培育成功的ApoE基因敲除小鼠是目前AS研究領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛的基因工程動(dòng)物，已成為探討AS發(fā)生發(fā)展機(jī)制和治療措施等理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[9]。本研究顯示，8周齡ApoE-/-小鼠經(jīng)14周“西方類型”膳食飼養(yǎng)至22周齡時(shí)，AS模型組（安靜對照組）小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積廣泛，主動(dòng)脈斑塊面積占管腔面積的比例達(dá)（41．79±6．93）%；主動(dòng)脈切片HE染色顯示，模型組血管內(nèi)膜損傷嚴(yán)重，可見大量由泡沫細(xì)胞形成的脂紋期和纖維斑塊期病變。結(jié)果表明，22周齡ApoE-/ -小鼠已形成動(dòng)脈粥樣硬化。

通過14周耐力運(yùn)動(dòng)干預(yù)顯著抑制了ApoE-/-小鼠AS斑塊的進(jìn)展，運(yùn)動(dòng)組小鼠主動(dòng)脈斑塊面積顯著低于對照組，并且主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷較輕。表明耐力運(yùn)動(dòng)延緩了ApoE-/-小鼠AS斑塊的形成和病變程度，為耐力運(yùn)動(dòng)能有效地預(yù)防AS發(fā)生提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.2 耐力運(yùn)動(dòng)對ApoE-/-小鼠血脂的影響

本實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過14周耐力運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，運(yùn)動(dòng)組小鼠血清TC、TG、LDL、HDL水平與模型組之間無顯著性差異，表明14周中等強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)干預(yù)對ApoE-/-小鼠血脂未產(chǎn)生明顯影響，這與近年來一些研究報(bào)道相一致[10-12]。我們認(rèn)為，ApoE的缺失可能是造成運(yùn)動(dòng)對ApoE-/-小鼠血脂影響不顯著的原因之一。研究結(jié)果提示，耐力運(yùn)動(dòng)對ApoE-/-小鼠AS的影響可能存在著血脂之外的其它機(jī)制。

3.3 耐力運(yùn)動(dòng)對ApoE-/-小鼠NO/NOS系統(tǒng)的影響及其在抗AS中的作用

近年來，NO在AS發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是AS的一個(gè)早期特征，表現(xiàn)為血管源性的NO產(chǎn)生減少及炎性細(xì)胞粘附分子表達(dá)增加。NO由L-精氨酸（L-Arg）在一氧化氮合酶（NOS）的催化下生成。NOS有三種亞型：神經(jīng)元型NOS（nNOS）、內(nèi)皮型NOS（eNOS）、誘導(dǎo)型NOS（iNOS）。內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的eNOS參與產(chǎn)生少量的NO，具有抗血小板聚集及抑制白細(xì)胞粘附等多種功能；iNOS可被某些炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO，加重炎癥反應(yīng)對機(jī)體造成的損害。研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)NO合成減少，其生物學(xué)作用下降，eNOS表達(dá)下降、活性降低，而iNOS表達(dá)增強(qiáng)[1-2]。提示血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO減少導(dǎo)致的血管功能不良是AS形成的原因之一。

已有研究報(bào)道，運(yùn)動(dòng)能有效地調(diào)節(jié)NO合成及NOS表達(dá)，運(yùn)動(dòng)可明顯升高NO水平，促進(jìn)血管壁NOS表達(dá)，并增強(qiáng)NOS的活性[3]。Hambreoht等研究發(fā)現(xiàn)，慢性心臟病患者進(jìn)行6個(gè)月體育鍛煉后，使內(nèi)皮NO生成增加[4]。殷松樓將Wistar大鼠分為對照組和運(yùn)動(dòng)組，發(fā)現(xiàn)游泳運(yùn)動(dòng)組（1．5 h/d，5 d/w，共4周）主動(dòng)脈NOS活性較對照組明顯增強(qiáng)[11]。本研究顯示，14周耐力運(yùn)動(dòng)干預(yù)使ApoE-/-小鼠血中NO和主動(dòng)脈壁eNOS蛋白表達(dá)增加，iNOS蛋白表達(dá)降低，并有效地延緩主動(dòng)脈AS的發(fā)生，表明運(yùn)動(dòng)對一氧化氮系統(tǒng)的調(diào)控作用可能是運(yùn)動(dòng)減輕動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。

耐力運(yùn)動(dòng)通過改善NO/NOS系統(tǒng)機(jī)能而發(fā)揮抗AS的作用，可能與以下兩個(gè)機(jī)制有關(guān)：其一，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，大量的iNOS被誘導(dǎo)和激活，高速、持續(xù)地產(chǎn)生大量NO，它與過氧化物結(jié)合生成一種氧化性更強(qiáng)的過氧亞硝酸鹽化合物，可使LDL發(fā)生氧化，促進(jìn)AS的發(fā)展。通過耐力運(yùn)動(dòng)可以有效地抑制iNOS激活和表達(dá)，從而產(chǎn)生較少的過氧亞硝酸鹽化合物，使得運(yùn)動(dòng)組比模型組iNOS蛋白表達(dá)降低，AS病變減輕。其二，耐力運(yùn)動(dòng)促進(jìn)eNOS蛋白表達(dá)和提高血中NO水平可能與運(yùn)動(dòng)加快血流速度、增加血管壁切應(yīng)力有關(guān)。Shen W等報(bào)道，運(yùn)動(dòng)時(shí)心輸出量增加，血液發(fā)生重新分配，肌肉及冠狀動(dòng)脈循環(huán)的血流量增多，血流加速，使血管壁剪切力增大，促使eNOS催化的NO增多[14]。由此認(rèn)為，耐力運(yùn)動(dòng)通過促進(jìn)主動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)、提高血中NO水平和改善血管內(nèi)皮功能等而發(fā)揮抗AS的作用，這可能是獨(dú)立于血脂調(diào)節(jié)作用以外的抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制。

4 結(jié)論

（1）14周耐力運(yùn)動(dòng)干預(yù)使ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊面積減少、病變減輕，從而延緩了AS的形成。（2）14周耐力運(yùn)動(dòng)能有效地增加ApoE-/-小鼠eNOS蛋白表達(dá)和提高生物活性形式的NO水平，并抑制iNOS蛋白表達(dá)，這可能是獨(dú)立于血脂調(diào)節(jié)作用以外的另一抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制。

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ZHANG Hongxia1,2,LIU Shanyun1,LINing1,FENGHong1,WANGHongtao1,WANGMin1,XU Xinnv3,WANG Jinhuan3
（1．Tianjin University of Sport,Tianjin 300381,China;2．Dept．of Clinical Training,Tianjin University of Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;3．Key Lab of Emergence Medicine ofMOH,Tianjin First Center Hospital,Tianjin 300192,China）

Objective:The influence of endurance exercise on the function of preventing from atherosclerosis formation and effects of endurance exercise on NO system in ApoE-deficientmicewere investigated to probe possiblemechanisms of anti-atherosclerosis by endurance exercise．Methods:Twenty-four 8-week old ApoE-deficientmice were selected and divided into atherosclerosismodel group and exercise group randomly．There were twelvemice in each group．Mice of exercise group were trained on treadmill for fourteen weeks．Followings were detected:1)the square of atherosclerotic plaque and pathological change;2)the serum NO and the blood lipid;3)the protein expression of thoracic aortic iNOS and eNOS．Results:The square of aorta plaque was significantly smaller in ApoE-deficientmice of exercise group than that in mice of control group(P＜0．01)．The degree of lesion in aorta wall and tunica intima was lighter in ApoE-deficientmice with endurance exercise．The concentration of serum NO and protein expression of aorta eNOS were significantly increased(P＜0．01)in ApoE-deficientmicewith endurance exercise．The protein expression of aorta iNOSwas significantly decreased(P＜0．05)in ApoE-deficientmice with endurance exercise．There was no change on the blood lipid．Conclusions:The present study demonstrated that endurance exercisemay contribute to its anti-atherosclerosis function by significantly increasing eNOS protein expression and blood NO level aswell as inhibiting iNOS protein expression．

endurance exercise;ApoE-deficientmice;atherosclerosis;nitric oxide;nitric oxide synthase

G 804．23

A

1005-0000（2010）02-0122-03

2010-01-06；

2010-03-03；錄用日期：2010-03-06

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：08JCYBJC06000）

張洪俠（1978-），女，安徽宿州人，天津中醫(yī)藥大學(xué)助理實(shí)驗(yàn)師。通訊作者：劉善云（1958-），女，天津市人，博士，天津體育學(xué)院教授。

1.天津體育學(xué)院，天津300381；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)臨床實(shí)訓(xùn)教學(xué)部，天津300193；3.天津市第一中心醫(yī)院衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300192。