RP—HPLC法測(cè)定小兒肺熱咳喘口服液中黃芩苷含量

【摘要】目的:建立一種可測(cè)定小兒肺熱咳喘口服液中黃芩苷的RP-HPLC方法。方法:采用Shim-pack VP-ODS(250mm×4.6mm5μm)為色譜柱;流動(dòng)相為甲醇-0.3%磷酸溶液(42:58);檢測(cè)波長(zhǎng)為277nm;流速為1.0mL/min;柱溫為40℃;峰面積外標(biāo)法定量;結(jié)果:本法黃芩苷在1.044×10-2μg～2.61μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，(r=0.999995)，平均回收率為99.0%，RSD0.99%;結(jié)論:本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確可靠，可作為該制劑的質(zhì)控方法。

【關(guān)鍵詞】小兒肺熱咳喘口服液;黃芩苷;高效液相色譜法;含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R917【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2010)12-107-2

Determination of baicalin in Xiao’er feire kequan Oral Liquid by RP-HPLC

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Quzhou Institute for Drug Control，Quzhou，China 324002

ABSTRACT:AIM:To establish a RP-HPLC method for determining the content of baicalin in Xiao’er feire kequan Oral Liquid.METHODS:A Shim-pack C_(18)column was used.The mobile phase wasmethanol-0.3%Phosphoric acid solution(42:58).The detection wavelength was 277nm. RESULTS:The linear range of baicalin was1.044×10-2μg～2.61μg(r=0.999995).The average recovery(n=9) was 99.0%.RSD was 0.99%. CONCLUSION:The method is simple，reliable，accurate and can be applied to the quality control of the preparetion.

KEYWORDS:baicalin;Xiao’er feire kequan Oral Liquid;RP-HPLC

小兒肺熱咳喘口服液是由麻黃、苦杏仁、黃芩、金銀花、石膏等中藥組方制成的中藥制劑，具有清熱解毒，宣肺化痰功效，用于熱邪犯于肺衛(wèi)所致發(fā)熱、汗出、微惡風(fēng)寒、咳嗽、痰黃，或兼喘息、口干而渴等癥。收載于《中國(guó)藥典》2005年版一部，原標(biāo)準(zhǔn)對(duì)黃芩沒有鑒別項(xiàng)控制，也沒有含量測(cè)定控制[1]。本文采用高效液相色譜法測(cè)定小兒肺熱咳喘口服液中黃芩苷，結(jié)果準(zhǔn)確，操作方便，可用于該制劑的質(zhì)量控制。經(jīng)方法學(xué)研究，證明本法可行?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1儀器與試藥

日本島津LC—2010A高效液相色譜儀，自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng);Lcsolution Version 1.11 SP1色譜數(shù)據(jù)工作站;日本島津UV-2100紫外分光光度計(jì);KQ-250B型超聲波清洗器(功率:250W，頻率:40KHz)。甲醇為色譜純;磷酸、乙醇均為分析純;水為重蒸餾水;黃芩苷對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):黃芩苷110715-200212(供含量測(cè)定用)。小兒肺熱咳喘口服液(市售，批號(hào):200803061、200803028、200804059、200804079、200805044、200805049)。

2色譜條件

色譜柱:Shim-pack VP-ODS(250mm×4.6mm 5μm)為色譜柱;甲醇-0.3%磷酸溶液(42:58);檢測(cè)波長(zhǎng)為277nm;流速為1.0mL/min;柱溫為40℃;峰面積外標(biāo)法定量。

3方法與結(jié)果

3.1供試品溶液的制備

3.1.1樣品溶液的制備

取本品適量，混勻，精密量取1mL，置50mL容量瓶中，加入70%乙醇至近刻度，密塞，超聲處理10分鐘(功率:250W，頻率:40KHz)，放冷至室溫，用70%乙醇加至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.1.2陰性空白對(duì)照溶液的制備

按其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的處方比例，制備缺味(黃芩)中藥的陰性空白樣品對(duì)照液，照上述樣品溶液的制備方法制成陰性空白對(duì)照溶液。

3.1.3對(duì)照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)60℃減壓干燥4小時(shí)的黃芩苷對(duì)照品適量，加70%乙醇使溶解，定容，制成每1mL含黃芩苷約100μg的對(duì)照品溶液。

3.2系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取黃芩苷對(duì)照品溶液、陰性空白對(duì)照溶液和樣品溶液，按上述色譜條件下進(jìn)10μL，得HPLC圖譜，結(jié)果見圖1。由圖1C可知，陰性空白對(duì)照溶液在黃芩苷對(duì)照品出峰處沒有干擾峰出現(xiàn)，故樣品中的其他組分對(duì)黃芩苷測(cè)定無(wú)干擾作用。理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算不應(yīng)低于4000。分離度大于1.5，黃芩苷對(duì)稱因子為0.95～1.05之間。

A.對(duì)照品圖譜B.樣品圖譜C.陰性空白對(duì)照品圖譜

圖1 對(duì)照品、樣品及陰性空白對(duì)照液的HPLC圖

3.3線性關(guān)系的考察

精密稱取經(jīng)60℃減壓干燥4小時(shí)的黃芩苷對(duì)照品13.05mg，置25mL量瓶中，用70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置25mL量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取對(duì)照品溶液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10、15、20、25μL，注入高效液相色譜儀，按上述條件測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、黃芩苷進(jìn)樣濃度(x)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:黃芩苷Y=3.2529×106X+5.0749×103，r=0.999995，結(jié)果表明黃芩苷在1.044×10-2μg～2.61μg之間呈良好的線性關(guān)系。

3.4精密度試驗(yàn)

取同一批供試品溶液(批號(hào):200803061)，進(jìn)樣10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得:黃芩苷峰面積的RSD為50.19%。再取黃芩苷對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得:黃芩苷峰面積的RSD為50.11%。

3.5重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品5份(批號(hào):200803061)，按3.1.1項(xiàng)下樣品溶液的制備方法制備供試液，平行測(cè)定，得:黃芩苷的含量為3.1725mg·mL-1，RSD為0.26%(n=5)。說(shuō)明方法重現(xiàn)性良好。

3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品溶液(批號(hào):200803061，黃芩苷的含量為3.1725mg·mL-1)，在常溫下放置12h，每間隔2h測(cè)定一次，連續(xù)共測(cè)定6次，得:黃芩苷峰面積RSD為1.19%。表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7回收率試驗(yàn)

采用加樣回收試驗(yàn)方法，精密量取已知黃芩苷含量(批號(hào):200803061，黃芩苷含量為3.1725mg·mL-1)的樣品5mL，置10mL容量瓶中，加入70%乙醇至近刻度，密塞，超聲處理10分鐘(功率:250W，頻率:40KHz)，放冷至室溫，用70%乙醇加至刻度，搖勻，精密量取9份1mL此樣品稀釋液，分置50mL容量瓶中，分別加入一定量對(duì)照品(加入量分為三個(gè)濃度:低、中、高)，照3.1.1項(xiàng)下操作，分別按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算結(jié)果見(表1)

3.8樣品含量測(cè)定

精密量取樣品1mL，按3.1.1項(xiàng)下方法制備供試樣品溶液。另精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，同3.1.3項(xiàng)下制備對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10μL，記錄黃芩苷峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=4)

樣品批號(hào)黃芩苷含量(mg·mL-1)RSD(%)

200803061

200803028

200804059

200804079

200805044

2008050493.1725

3.1970

3.1663

2.7192

3.4426

3.20010.26

0.11

0.43

0.15

0.66

0.18

4討論

4.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取上述黃芩苷對(duì)照品溶液，在紫外分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)200nm～500nm處掃描，結(jié)果在277nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故以277nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2提取方法的選擇筆者曾用70%乙醇、甲醇，分別超聲提取10、30、60分鐘后進(jìn)樣測(cè)定峰面積比較，結(jié)果超聲處理10分鐘以后黃芩苷峰面積基本不變，故選用超聲處理10分鐘;70%乙醇與甲醇稀釋的含量基本一致，考慮到70%乙醇比甲醇更經(jīng)濟(jì)環(huán)保，故選用70%乙醇超聲處理。

4.3柱溫的選擇柱溫雖對(duì)組分的分離度影響較小，但對(duì)樣品組分的保留時(shí)間(tR值)影響較大，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn):柱溫在40℃時(shí)既可加快分析速度，又可保持出峰時(shí)間的恒定，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

4.4流動(dòng)相的確定筆者比較了甲醇-0.3%磷酸溶液(42:58)、甲醇-2%醋酸(50:50)、乙腈-水(33:67)、乙腈-0.2%磷酸(30:70)、乙腈-冰醋酸-24%四丁基溴化銨-水(33:1:1:75)等多種流動(dòng)相，結(jié)果以甲醇-0.3%磷酸溶液(42:58)分離效果、出峰時(shí)間快、配制簡(jiǎn)便，綜合考慮最好，故選用此為流動(dòng)相。然后又對(duì)甲醇與不同濃度的磷酸溶液配比對(duì)峰形的影響進(jìn)了考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著磷酸濃度的增加，峰形進(jìn)一步變尖銳。但考慮到酸度對(duì)色譜柱的影響(要求流動(dòng)相PH應(yīng)大于2.0)，流動(dòng)相pH值不宜過低，故選用此比例。

4.5黃芩具清熱、燥濕、解毒、止血功效是處方中清熱解毒的主要藥味，黃芩中主要成分為黃芩苷[2]，為此，選擇黃芩中的黃芩苷為含量測(cè)定指標(biāo)，建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果滿意，方法的重現(xiàn)性好，可作為該制劑的質(zhì)控方法。

4.6存在問題和不足本次實(shí)驗(yàn)用樣品，為筆者從市場(chǎng)上購(gòu)買所得，只有六個(gè)批號(hào)，再者，本次實(shí)驗(yàn)用儀器與色譜柱也只有一種，故本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有一定的局限性。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)藥典一部[S].2005:346.

[2] 肖培根.新編中藥志(第一卷)[M].北京化學(xué)工業(yè)出版社，2002:862-875.