美洲商陸毛狀根誘導(dǎo)及其離體培養(yǎng)的影響因素

施和平，朱遠(yuǎn)鋒，曾寶強(qiáng)，周卓輝，余震傲，黃勝琴

1 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510631

2 香港教育學(xué)院 科學(xué)與環(huán)境學(xué)系，香港 新界

美洲商陸毛狀根誘導(dǎo)及其離體培養(yǎng)的影響因素

施和平1，朱遠(yuǎn)鋒1，曾寶強(qiáng)2，周卓輝2，余震傲1，黃勝琴1

1 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510631

2 香港教育學(xué)院 科學(xué)與環(huán)境學(xué)系，香港 新界

施和平, 朱遠(yuǎn)鋒, 曾寶強(qiáng), 等. 美洲商陸毛狀根誘導(dǎo)及其離體培養(yǎng)的影響因素. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(2): 272–283.

Shi HP, Zhu YF, Tsang PKE, et al. Factors influencing induction andin vitroculture of hairy roots inPhytolacca americanaL. Chin J Biotech, 2017, 33(2): 272–283.

為了探討利用美洲商陸毛狀根生產(chǎn)其藥用成分的可能性，研究了美洲商陸毛狀根誘導(dǎo)及其離體培養(yǎng)的影響因素。結(jié)果表明，美洲商陸葉片外植體被發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC 15834感染約18 d后，從其葉片外植體形態(tài)學(xué)下端葉脈切口處產(chǎn)生毛狀根，其中以預(yù)培養(yǎng)1 d，農(nóng)桿菌感染20 min，共培養(yǎng)4 d時(shí)的毛狀根誘導(dǎo)率最高，達(dá)到70%。PCR擴(kuò)增和硅膠薄層層析結(jié)果顯示，發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的rolC基因以及冠癭堿合成酶基因已在美洲商陸毛狀根基因組中整合和表達(dá)。所獲得的美洲商陸毛狀根系都能在無(wú)外源激素的MS固體培養(yǎng)基上快速自主生長(zhǎng)；其中以毛狀根根系2的生長(zhǎng)速度最快、分生側(cè)根能力最強(qiáng)和根表面的根毛密度最高；毛狀根根表面呈紫紅色或呈白色。在供試的MS、1/2MS、B5和6,7-V液體培養(yǎng)基中，以無(wú)外源激素的MS培養(yǎng)基最適合美洲商陸毛狀根根系生長(zhǎng)。與無(wú)外源激素的MS培養(yǎng)基相比，6,7-V培養(yǎng)基更有利于毛狀根中商陸皂苷甲的合成與積累。本文所建立的美洲商陸毛狀根誘導(dǎo)及其離體培養(yǎng)的適宜條件為今后利用其毛狀根株系的規(guī)模培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)其藥用有效成分商陸皂苷甲奠定了實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)。

美洲商陸，發(fā)根農(nóng)桿菌，毛狀根，商陸皂苷甲

毛狀根(Hairy root) 是由發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogenes感染植物細(xì)胞后，其Ri質(zhì)粒 (Root inducing plasmid，Ri plasmid) 的T-DNA片段在植物細(xì)胞核基因組中插入、整合與穩(wěn)定表達(dá)的結(jié)果[1]。到目前為止，雖然有較多藥用植物和園藝植物通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了可自主生長(zhǎng)毛狀根[2-3]，但對(duì)某一種發(fā)根農(nóng)桿菌而言，如何提高其Ri質(zhì)粒對(duì)植物細(xì)胞的致根效率以及拓寬其寄主范圍，一直是植物遺傳轉(zhuǎn)化中亟待解決的問(wèn)題。一些研究表明，在發(fā)根農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞雙向作用產(chǎn)生毛狀根的復(fù)雜過(guò)程中，能否產(chǎn)生毛狀根，不僅取決于發(fā)根農(nóng)桿菌菌株本身的致病力外，還與感染部位、外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、極性和乙酰丁香酮濃度等生理因素密切相關(guān)[4-5]。美洲商陸Phytolacca americanaL.，又名垂絮商陸，是一種以根入藥的傳統(tǒng)中藥。其根部藥用成分商陸皂苷甲具有免疫調(diào)節(jié)[6]、抗炎[7]等多種藥效。但目前其生藥來(lái)源仍主要靠挖掘野生資源為主。由于野生資源極其有限，挖掘野生資源又易造成水土流失，破壞環(huán)境；而人工栽培又因生產(chǎn)周期太長(zhǎng)，因而很難滿足制藥工業(yè)的市場(chǎng)需求。而利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的可自主快速生長(zhǎng)的美洲商陸毛狀根來(lái)生產(chǎn)其藥用有效成分，無(wú)疑是一條合理可行的可持續(xù)的生物技術(shù)途徑。本文報(bào)道發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)美洲商陸的遺傳轉(zhuǎn)化以及有關(guān)毛狀根產(chǎn)生及其離體培養(yǎng)的影響因素，以期為今后利用其毛狀根的規(guī)模培養(yǎng)來(lái)產(chǎn)生其次生物質(zhì)商陸皂苷等奠定實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)和提供可能性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株及其活化培養(yǎng)

含野生農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌A. rhizogenesATCC15834，由德國(guó)馬丁·路德大學(xué)藥物生物學(xué)院Peter Lindemann博士提供。挑取其單菌落接種于液體YEB培養(yǎng)基中，于160 r/min、28 ℃暗培養(yǎng)30 h后，供感染用。

1.2 毛狀根的誘導(dǎo)及其影響因素

取溫室盆栽的美洲商陸P. americanaL. 植株的幼嫩葉片，用0.1%升汞消毒滅菌8?10 min，無(wú)菌水漂洗4?5次后，切成1?2 cm2左右葉片外植體后，用于轉(zhuǎn)化。為了探討發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)美洲商陸葉片外植體產(chǎn)生毛狀根的適宜條件，研究了外植體預(yù)培養(yǎng)0?4 d和共培養(yǎng)2?4 d等因素對(duì)葉片外植體產(chǎn)生毛狀根的影響 (圖2和圖3)。將未預(yù)培養(yǎng)或預(yù)培養(yǎng)1?4 d的葉片外植體浸入用MS[8]培養(yǎng)基稀釋2倍的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌懸液中20 min，取出、吸干多余菌液并放回原培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2?4 d后，轉(zhuǎn)入MS+500 mg/L頭胞噻肟鈉 (Cefotaxime sodium) 的無(wú)外源激素的MS培養(yǎng)基上，在25 ℃每天14 h散射光下誘導(dǎo)毛狀根。切取從葉片外植體產(chǎn)生的毛狀根置于含500 mg/L頭胞噻肟鈉的無(wú)外源激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行單根除菌培養(yǎng)，直到獲得無(wú)菌的毛狀根。所獲得的無(wú)菌不定根置于無(wú)外源激素的MS固體培養(yǎng)基上保存，供毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化鑒定、毛狀根液體培養(yǎng)和商陸皂苷甲含量測(cè)定用。

1.3 毛狀根的遺傳轉(zhuǎn)化鑒定

采用Ri質(zhì)粒TL-DNA (T-DNA左臂)rol基因的PCR擴(kuò)增和TR-DNA (T-DNA右臂) 的冠癭堿合成酶基因表達(dá)產(chǎn)物的硅膠薄層層析來(lái)對(duì)美洲商陸毛狀根進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化鑒定。

1.3.1 毛狀根rol基因的PCR擴(kuò)增

選取可在無(wú)激素MS培養(yǎng)基中快速自主生長(zhǎng)的9個(gè)無(wú)菌毛狀根根系各100 mg，按Edwards等[9]的方法提取毛狀根基因組DNA，純化后用作PCR擴(kuò)增的模板。以野生型美洲商陸根的基因組DNA作陰性對(duì)照，以發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834的質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)Furner等[10]發(fā)表的序列，設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增rolC的PCR引物，rolC引物：P1：5′-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3′，P2：5′-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3′；(引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。在0.2 mL的硅化離心管中加入模板DNA 50 ng，TaqDNA聚合酶2個(gè)單位，PCR反應(yīng)總體積為50 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)如下：94 ℃預(yù)熱3 min；94 ℃變性1 min，53.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸反應(yīng)1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和GoldView (GV) 染色進(jìn)行分析。

1.3.2 冠癭堿的硅膠薄層層析

參照Tanaka等[11]的方法進(jìn)行并略加修改。

取美洲商陸毛狀根根系以及發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌體各適量，充分研磨成粉狀后，加入70%乙醇，浸泡過(guò)夜，次日離心取上清液濃縮，點(diǎn)樣于硅膠薄層層析板 (GF254型，10 cm× 20 cm，青島海洋化工廠分廠出品) 上，展層、染色和拍照。

1.4 培養(yǎng)基類型對(duì)美洲商陸毛狀根生長(zhǎng)和次生物質(zhì)含量的影響

為了探討培養(yǎng)基類型對(duì)美洲商陸毛狀根生長(zhǎng)的影響，選取生長(zhǎng)最旺盛的無(wú)菌毛狀根根系2和根系5，定量接種至盛有50 mL MS、1/2MS、B5或6,7-V[12]四種液體培養(yǎng)基的150 mL錐形瓶中，起始接種量約為0.2 g FW/瓶。將培養(yǎng)瓶置于轉(zhuǎn)速為100 r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床上，于(25±2) ℃下振蕩培養(yǎng)。為了測(cè)定培養(yǎng)基類型對(duì)毛狀根次生物質(zhì)商陸皂苷產(chǎn)生的影響，將生長(zhǎng)最迅速的毛狀根根系2分別接入MS和6,7-V液體培養(yǎng)基進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)，每瓶起始接種量約為0.2 g FW，培養(yǎng)條件同上。在為期25 d的液體培養(yǎng)過(guò)程中，每隔5 d隨機(jī)抽取毛狀根培養(yǎng)物3瓶，用吸水紙吸去培養(yǎng)物表面的培養(yǎng)液后，稱鮮重并置于60 ℃烘干至恒重后，供測(cè)定其商陸皂苷甲含量用。

1.5 商陸皂苷甲含量的HPLC測(cè)定

上述經(jīng)MS和6,7-V培養(yǎng)基液體培養(yǎng)5–25 d且烘干至恒重的美洲商陸毛狀根根系，碾磨成細(xì)粉并過(guò)40目篩后，精密稱取毛狀根根系過(guò)篩后的粉末各1 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，用移液管加入50%乙醇30 mL，稱重并記錄帶瓶重量，超聲 (500 W、40 kHz) 處理30 min，放冷至室溫后，用50%乙醇補(bǔ)足至原重量，搖勻，過(guò)濾，收集濾液即得待測(cè)樣品。毛狀根樣品的商陸皂苷甲含量的HPLC測(cè)定基本參照賴道萬(wàn)等[13]的方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)條件為：日本HITACHI L-7110型高效液相色譜儀，美國(guó)Alltech ELSD-2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；色譜柱為Diamonsil C18 (5 μm×250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相為甲醇-水(75∶25)；流速為1.0 mL/min；柱溫為室溫；進(jìn)樣量20 μL；飄移管溫度74 ℃；載氣流速2.0 L/min。商陸皂苷甲標(biāo)準(zhǔn)品 (20 mg/支，購(gòu)于深圳時(shí)得佳科技有限公司) 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=2 967.4x–24 072，r2=0.999 5；并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各毛狀根樣品的商陸皂苷甲含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 美洲商陸毛狀根的誘導(dǎo)

發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834感染美洲商陸葉片外植體共培養(yǎng)2 d后，可見(jiàn)葉片外植體邊緣開(kāi)始向上卷曲，同時(shí)葉片周圍開(kāi)始出現(xiàn)少量乳白色的菌落。將外植體轉(zhuǎn)到含500 mg/L頭孢噻肟鈉的MS固體培養(yǎng)基上除菌培養(yǎng)8 d后，可見(jiàn)部分葉片外植體的近葉柄端切口葉脈處或附近 (即形態(tài)學(xué)下端) 表面產(chǎn)生白色根原基。15 d后出現(xiàn)根尖，根尖部分呈紫紅色。18–22 d后部分葉片外植體的白色根原基發(fā)育伸長(zhǎng)形成長(zhǎng)約1–3 cm的不定根 (圖1A)。從圖1可見(jiàn)，幾乎所有的主根周圍都有較多的側(cè)根，主根大都呈白色、根尖呈淺紫紅色、較粗壯、生長(zhǎng)速度快。側(cè)根呈白色，根尖部分無(wú)明顯紅色，側(cè)根較細(xì)，生長(zhǎng)速度較慢。而未經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌浸染的美洲商陸葉片外植體置于相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后均不生根，且可見(jiàn)部分葉片外植體逐漸黃化或變褐死亡。

為了探討發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)美洲商陸葉片外植體產(chǎn)生毛狀根的適宜條件，研究了預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)葉片外植體產(chǎn)生毛狀根的影響。圖2為預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)美洲商陸葉片外植體毛狀根誘導(dǎo)的影響。從圖2可見(jiàn)，葉片外植體經(jīng)不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間處理后，其毛狀根的誘導(dǎo)率不同。未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的葉片外植體感染后，其邊緣發(fā)生褐化，毛狀根誘導(dǎo)率較低；而不同時(shí)間預(yù)培養(yǎng)的葉片外植體感染發(fā)根農(nóng)桿菌后，以預(yù)培養(yǎng)1 d的葉片外植體的毛狀根誘導(dǎo)效果最好，其毛狀根誘導(dǎo)率可達(dá)45%，但隨著預(yù)培養(yǎng)天數(shù)的增加，葉片外植體的毛狀根誘導(dǎo)率反而下降，其中預(yù)培養(yǎng)4 d的葉片外植體甚至不能誘導(dǎo)出毛狀根。

圖1 美洲商陸葉片外植體毛狀根的誘導(dǎo)及其離體培養(yǎng)Fig. 1 Induction of hairy root from leaf explants ofP.americanaL. and itsin vitroculture. (A) Hairy root formation from leaf explants after infected withA. rhizogenesATCC15834 for 20 days. (B) Hairy root line 1 on solid medium. (C) Hairy root line 2 on solid medium. (D) Hairy root line 3 on solid medium. (E) Hairy root line 4 on solid medium. (F) Hairy root line 5 on solid medium. (G) Hairy root line 6 in liquid medium. (H) Hairy root line 7 in liquid medium.

圖2 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)葉片外植體產(chǎn)生毛狀根的影響Fig. 2 Effect of pre-culture time on the formation of hairy roots from leaf explants.

圖3為發(fā)根農(nóng)桿菌感染后，共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)美洲商陸葉片外植體毛狀根誘導(dǎo)率的影響。從圖3可見(jiàn)，葉片外植體的毛狀根誘導(dǎo)率可因共培養(yǎng)時(shí)間不同而有差異。在2–4 d的共培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，毛狀根的誘導(dǎo)率逐漸上升，其中以共培養(yǎng)4 d時(shí)，葉片外植體的毛狀根誘導(dǎo)率最高，達(dá)70%。但共培養(yǎng)5 d時(shí)，葉片外植體的毛狀根誘導(dǎo)率則降低至65%。同時(shí)還觀察到，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片外植體周圍長(zhǎng)滿乳白色農(nóng)桿菌菌落，進(jìn)而可見(jiàn)部分葉片外植體逐漸褐化和壞死。

2.2 美洲商陸毛狀根的固體培養(yǎng)

為了獲得無(wú)菌的毛狀根系，當(dāng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染后從葉片外植體上產(chǎn)生的不定根長(zhǎng)到3–5 cm時(shí)、分別切下并置于無(wú)外源激素的MS+500 mg/L頭孢噻肟鈉的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行單根除菌培養(yǎng)，每7 d左右轉(zhuǎn)到新的MS+500 mg/L頭孢噻肟鈉的固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，直到獲得無(wú)菌毛狀根培養(yǎng)物。通過(guò)形態(tài)觀察和比較發(fā)現(xiàn)，共獲得9個(gè)可在無(wú)外源激素培養(yǎng)基上自主生長(zhǎng)但其形態(tài)間存在差異的毛狀根。其中，無(wú)論是固體培養(yǎng)還是液體培養(yǎng)，根系5和6的根表面局部呈現(xiàn)紫紅色，且紫紅色主要出現(xiàn)在其根尖和離根尖較近的分生區(qū)部位 (圖1F和G)；而其余毛狀根根系的根表面為白色 (圖1B、C、D、E和H)；在所獲得的毛狀根系中，以根系2的側(cè)根發(fā)生能力最強(qiáng)，側(cè)根最多，根毛分布最密 (圖1C)，而以根系1的側(cè)根最少 (圖1B)。

圖3 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)美洲商陸葉片外植體產(chǎn)生毛狀根的影響Fig. 3 Effect of co-cultivation time on the formation of hairy roots from leaf explants.

2.3 美洲商陸毛狀根的PCR鑒定

rolC是發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒TL-DNA (T-DNA左臂) 上的一個(gè)生根基因。為了對(duì)所獲得的9個(gè)毛狀根系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化鑒定，以rolC的引物分別對(duì)美洲商陸野生植株的根部DNA、美洲商陸毛狀根基因組DNA及發(fā)根農(nóng)桿菌單菌落DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖4。從圖4可見(jiàn)，利用rolC的PCR引物能從9個(gè)美洲商陸毛狀根的總DNA及發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834單菌落克隆中擴(kuò)增到期望的、大小為540 bp的特異性DNA片段；而從美洲商陸野生型植株根部總DNA中擴(kuò)增不到任何片段。這說(shuō)明，發(fā)根農(nóng)桿菌中含rolC基因的Ri質(zhì)粒的TL-DNA片段(T-DNA左臂) 已在美洲商陸毛狀根基因組中整合并得到表達(dá)。

圖4 美洲商陸毛狀根根系1-9的rolC基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析Fig. 4 Gel electrophoresis analysis of PCR fragments ofrolC genes amplified from the genomic DNA ofP. americanaL. hairy root line 1–9. 1: 2 000 bp DNA marker; 2:A. rhizogenesATCC15834; 3: untransformed root ofP. americanaL.; 4–12: hairy root lines 1–9 ofP. americanaL.

當(dāng)發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的TR-DNA (T-DNA右臂) 部分整合到宿主植物細(xì)胞DNA后，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中就能合成特異的冠癭堿 (Opines)；而發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒本身雖有冠癭堿合成酶基因，但該基因只在真核生物中表達(dá)，其自身 (菌體) 不能合成冠癭堿[14]。如果美洲商陸毛狀根為Ri質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化，那么其細(xì)胞中就會(huì)有冠癭堿的合成，硅膠薄層層析顯色結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。因而，冠癭堿的有無(wú)也可作為Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的指標(biāo)之一。圖5為美洲商陸毛狀根根系冠癭堿的硅膠薄層層析檢測(cè)結(jié)果。從圖5可見(jiàn)，上述經(jīng)rol基因PCR擴(kuò)增呈陽(yáng)性的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌株誘導(dǎo)美洲商陸葉片外植體產(chǎn)生的毛狀根系均能檢測(cè)到冠癭堿 (甘露堿)，而對(duì)照根系及發(fā)根農(nóng)桿菌菌體中則檢測(cè)不到冠癭堿 (甘露堿)；這說(shuō)明，除發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的rol基因外，Ri質(zhì)粒的含編碼冠癭堿合成酶基因的TR-DNA也已在美洲商陸毛狀根系中整合并得到表達(dá)；而所獲得的可自主生長(zhǎng)的毛狀根系均為RiT-DNA轉(zhuǎn)化毛狀根。

圖5 美洲商陸毛狀根冠癭堿的硅膠薄層層析檢測(cè)Fig. 5 Detection of opines in hairy roots ofP. americanaby silica gel thin layer chromatography. 1: extract of agrobacterium; 2: control root extract; 3–10: extract of hairy root lines; Man: mannopine.

2.4 培養(yǎng)基類型對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的影響

為了研究液體培養(yǎng)基類型對(duì)美洲商陸毛狀根生長(zhǎng)的影響，將在固體培養(yǎng)中生長(zhǎng)快的毛狀根系2和5分別置于MS、6,7-V、1/2MS和B5液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。圖6為根系2和根系5分別在MS、6,7-V、1/2MS和B5四種培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d的生長(zhǎng)情況 (結(jié)果以鮮重增值倍數(shù)表示)。從圖6可見(jiàn)，在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后，毛狀根根系2的鮮重增值倍數(shù)達(dá)到了37.81倍，而毛狀根根系5則增加了29.34倍；在6,7-V培養(yǎng)基中，毛狀根根系2的鮮重增值倍數(shù)達(dá)到了21.09倍，而毛狀根根系5則增加了24.57倍。在1/2MS培養(yǎng)基液體培養(yǎng)20 d后，毛狀根根系2的鮮重增值倍數(shù)達(dá)到了23.45倍，而毛狀根根系5則只增值了18.67倍；而在B5培養(yǎng)基中，毛狀根根系2的鮮重增值倍數(shù)為16.89倍，而毛狀根根系5則只增加了15.92倍?？梢?jiàn)，在供試的4種培養(yǎng)基中，無(wú)論是毛狀根根系2還是毛狀根根系5，均以MS培養(yǎng)基為其最適合生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。對(duì)毛狀根根系2而言，培養(yǎng)基對(duì)其生長(zhǎng)促進(jìn)的影響順序?yàn)椋篗S＞1/2MS＞6,7-V＞B5；而對(duì)毛狀根根系5而言，培養(yǎng)基類型對(duì)其生長(zhǎng)影響的順序?yàn)椋篗S＞6,7-V＞1/2MS＞B5。而這表明培養(yǎng)基類型對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的影響可依毛狀根株系不同而異。

圖7為美洲商陸毛狀根根系2在MS和6,7-V培養(yǎng)基中的商陸皂苷甲含量動(dòng)態(tài)變化。從圖7可見(jiàn)，當(dāng)美洲商陸毛狀根根系2在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其商陸皂苷甲含量從培養(yǎng)后第5天開(kāi)始上升，10–15 d期間，其商陸皂苷甲含量幾乎保持不變，處于平臺(tái)期，而15 d以后，其商陸皂苷甲含量開(kāi)始迅速下降，在第20天時(shí)，商陸皂苷甲含量為1.211%，至第25天時(shí)，則下降至1.16%。而與MS培養(yǎng)基相比，6,7-V培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，不僅毛狀根的商陸皂苷甲含量變化曲線與其生長(zhǎng)曲線基本保持一致，而且其商陸皂苷甲含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，培養(yǎng)至25 d時(shí)，其商陸皂苷甲含量達(dá)到2.42%，約為同時(shí)期MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根商陸皂苷甲含量的2.09倍。表明，6,7-V培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更有利于商陸毛狀根商陸皂苷甲的合成。

圖6 培養(yǎng)基類型對(duì)美洲商陸毛狀根根系2和5生長(zhǎng)的影響Fig. 6 Effect of medium types on the growth ofP. americanahairy root line 2 and 5.

圖7 美洲商陸毛狀根根系2在MS和6,7-V培養(yǎng)基中的商陸皂苷甲含量動(dòng)態(tài)變化Fig. 7 Dynamic variation of EsA content inP. americanaL. hairy root line 2 cultured in MS and 6,7-V medium.

3 討論

發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生毛狀根的過(guò)程是發(fā)根農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞相關(guān)作用的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程。有研究表明，感染前對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)能夠提高外植體的毛狀根誘導(dǎo)率，且外植體預(yù)培養(yǎng)的最佳時(shí)間通常約為1–3 d[15]。如預(yù)培養(yǎng)2 d的新疆雪蓮Saussureain volucrataKar.et Kir.根段外植體被發(fā)根農(nóng)桿菌菌株R1601感染后，其毛狀根的誘導(dǎo)率可達(dá)100%[16]；但外植體預(yù)培養(yǎng)超過(guò)3 d時(shí)，則會(huì)降低外植體的毛狀根誘導(dǎo)率[17]；然而利用發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4和R1601誘導(dǎo)曼陀羅Datura stramoniumL.嫩葉外植體產(chǎn)生毛狀根時(shí)，其外植體的最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為4 d[18]。而這顯然與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不完全一致。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834誘導(dǎo)美洲商陸葉片外植體產(chǎn)生毛狀根時(shí)，其最適預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為1 d；但若預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，葉片外植體的毛狀根誘導(dǎo)率反而下降，預(yù)培養(yǎng)4 d的外植體甚至不能產(chǎn)生毛狀根。這表明，通過(guò)外植體預(yù)培養(yǎng)可提高其毛狀根誘導(dǎo)率，但其影響程度可因植物類型、外植體類型以及農(nóng)桿菌菌株類型不同而有差異。

在發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生毛狀根的過(guò)程中，通常將被發(fā)根農(nóng)桿菌感染后的葉片外植體置于無(wú)抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)2–3 d，讓發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒T-DNA的基因切割，轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中的過(guò)程，稱為“共培養(yǎng) (Co-cultivation)”。以往的研究表明，發(fā)根農(nóng)桿菌感染外植體后，通常需要的共培養(yǎng)時(shí)間一般為2–3 d[19]。然而在利用發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)白芥Sinapis alba外植體產(chǎn)生毛狀根時(shí)，其外植體的最佳共培養(yǎng)時(shí)間則為4–5 d[20]。而這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類似。在本實(shí)驗(yàn)中，感染發(fā)根農(nóng)桿菌后，美洲商陸葉片外植體的最佳共培養(yǎng)時(shí)間為4 d，其毛狀根的誘導(dǎo)率達(dá)到最高，約為70%；但超過(guò)4 d則外植體的毛狀根誘導(dǎo)率反而下降；甚至?xí)霈F(xiàn)因發(fā)根農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)，導(dǎo)致外植體出現(xiàn)毒害、褐化甚至死亡?？梢?jiàn)，在利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化植物外植體產(chǎn)生毛狀根時(shí)，其最佳共培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短可因植物類型而異。

已有的研究表明，在發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，由于T-DNA插入植物基因組的位置、長(zhǎng)度和拷貝數(shù)千差萬(wàn)別，植物感染部位就會(huì)產(chǎn)生在生長(zhǎng)形態(tài)、生理生化特性和次生代謝產(chǎn)物含量等方面各異的毛狀根克隆[21]。如利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株感染黃瓜葉片[22]或利用農(nóng)桿堿型菌株R1000感染黃瓜子葉[23]后都能得到3種具有明顯形態(tài)差異的毛狀根；而通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌R1601菌株對(duì)青蒿外植體的遺傳轉(zhuǎn)化所獲得的220個(gè)青蒿毛狀根系之間，無(wú)論在生長(zhǎng)還是側(cè)根分支能力均存在差異[24]。這些與本試驗(yàn)的結(jié)果類似。在本試驗(yàn)中，發(fā)根農(nóng)桿菌感染美洲商陸葉片外植體后獲得了9個(gè)具有明顯形態(tài)差異的毛狀根。有研究表明，同一菌株感染黃瓜同一外植體后，黃瓜3種表型毛狀根的產(chǎn)生可能與Ri質(zhì)粒的TL-DNA (T-DNA左臂) 和含AUX基因的TR-DNA同時(shí)被轉(zhuǎn)入并不同程度表達(dá)有關(guān)[22]；然而，在發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化蕓薹Brassica napus時(shí)，無(wú)論TL-DNA和TR-DNA是否同時(shí)被轉(zhuǎn)入，都不會(huì)出現(xiàn)黃瓜轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的毛狀根表型差異[25]。因而，本試驗(yàn)中發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化美洲商陸葉片外植體后9種不同形態(tài)差異毛狀根根系的產(chǎn)生，除可能與Ri質(zhì)粒的T-DNA片段插入位點(diǎn)和長(zhǎng)度的多態(tài)性有關(guān)外，還可能與美洲商陸本身的遺傳特性有關(guān)。

雖然毛狀根可在無(wú)激素培養(yǎng)基上自主快速生長(zhǎng)，但有研究表明，培養(yǎng)基類型是影響毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的重要因素之一[26-27]。如西洋參Panax quinquefoliumL.毛狀根在SJ-1培養(yǎng)基中生物量月增長(zhǎng)倍數(shù)達(dá)到31.1，而在B5和改良Nisch培養(yǎng)基中的月增長(zhǎng)倍數(shù)則分別為17.9和15.9倍[26]。而采用MS液體培養(yǎng)基、White和B5培養(yǎng)基分別培養(yǎng)人參毛狀根6周后，其干重增加量分別約為起始接種量的83.9、44.6和41.9倍，但該毛狀根在6,7-V培養(yǎng)基上則幾乎不生長(zhǎng)[27]。而這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不完全一致。在本實(shí)驗(yàn)供試的MS、1/2MS、6,7-V和B5培養(yǎng)基中，無(wú)論是毛狀根根系2還是毛狀根根系5，均以MS培養(yǎng)基為其最適合生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。對(duì)毛狀根根系2而言，培養(yǎng)基對(duì)其生長(zhǎng)促進(jìn)的影響順序?yàn)椋篗S＞1/2MS＞6,7-V＞B5；而對(duì)毛狀根根系5而言，培養(yǎng)基類型對(duì)其生長(zhǎng)影響的順序?yàn)椋篗S＞6,7-V＞1/2MS＞B5。表明，培養(yǎng)基類型對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的影響效果還與植物種類以及其毛狀根類型有關(guān)。然而，除可影響毛狀根的生長(zhǎng)和形態(tài)外，培養(yǎng)基的類型還會(huì)影響毛狀根次生物質(zhì)的產(chǎn)生與積累。如White培養(yǎng)基培養(yǎng)6周后，人參毛狀根的人參總皂苷含量可達(dá)到5.60%，而MS培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，其毛狀根中人參總皂苷含量?jī)H為4.85%[27]。此外，液體培養(yǎng)44 d后，6,7-V培養(yǎng)基培養(yǎng)的丹參毛狀根的生物量 (鮮重) 增殖倍數(shù)達(dá)到370.5，丹參酮含量達(dá)到0.041% (干重)；而MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根生物量(鮮重)增殖倍數(shù)為194.7，丹參酮含量則達(dá)到0.068%，表明6,7-V培養(yǎng)基適合丹參毛狀根的生長(zhǎng)，而MS培養(yǎng)基更有利于丹參毛狀根內(nèi)丹參酮的積累[28]。而這與本實(shí)驗(yàn)美洲商陸毛狀根的培養(yǎng)結(jié)果不一致。在本實(shí)驗(yàn)中，美洲商陸毛狀根中商陸皂苷甲的合成和積累不僅與培養(yǎng)基類型的影響有關(guān)，而且6,7-V培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更有利于商陸毛狀根商陸皂苷甲的合成。培養(yǎng)至25 d時(shí)，其商陸皂苷甲含量達(dá)到2.42%，約為同時(shí)期MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根商陸皂苷甲含量的2.09倍。而這表明，培養(yǎng)基類型對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物積累的影響效果可因植物種類以及毛狀根根系的不同而有差異。

本文所建立的美洲商陸毛狀根誘導(dǎo)及其離體培養(yǎng)的適宜條件為今后利用其毛狀根株系的規(guī)模培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)其藥用有效成分商陸皂苷甲奠定了實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Petit A, David C, Dahl GA, et al. Further extension of the opine concept: plasmids inAgrobacterium rhizogenescooperate for opine degradation. Mol Gen Genet, 1983, 190(2): 204–214.

[2] Shi HP, Long YY, Sun TS, et al. Induction of hairy roots and plant regeneration from the medicinal plantPogostemon cablin. Plant Cell Tissue Organ Cult, 2011, 107(2): 251–260.

[3] Hou LL, Shi HP, Yu W, et al. Induction of polyploid in hairy roots ofNicotiana tabacumand its plant regeneration. Chin J Biotech, 2014, 30(4): 581?594 (in Chinese).侯麗麗, 施和平, 余武, 等. 煙草毛狀根多倍體誘導(dǎo)及其植株再生. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(4): 581?594.

[4] Chen SY, Hou SS, Gui YL, et al.In vitrotransformation of cotyledons and hypocotyls ofGlycyrrhiza uralensisFisch byAgrobacterium rhizogenes. J Wuhan Bot Res, 1991, 9(4): 301–305 (in Chinese).陳士云, 侯嵩生, 桂耀林, 等. 發(fā)根土壤桿菌體外轉(zhuǎn)化甘草子葉及下胚軸. 武漢植物學(xué)研究, 1991, 9(4): 301–305.

[5] Shi HP, Li L, Pan RC. Effects of polarity and NAA concentration on transformation of cucumber cotyledons byAgrobacterium rhizogenes. J Trop Subtrop Bot, 1997, 5(3): 43–47 (in Chinese).施和平, 李玲, 潘瑞熾. 極性和NAA濃度對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化黃瓜子葉的影響. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 1997, 5(3): 43–47.

[6] Xiao ZY, Zheng QY, Zhang JP, et al. Effect of esculentoside A on autoimmune disease mice model. Acad J Sec Mil Med Univ, 2003, 24(10): 1108–1111 (in Chinese).肖振宇, 鄭欽岳, 張俊平, 等. 商陸皂苷甲對(duì)自身免疫綜合征模型小鼠的療效. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 24(10): 1108–1111.

[7] Zheng QY, Mai K, Pan XF, et al. Antiinflammatory effect of esculentoside A. Chin J Pharmacol Toxicol, 1992, 6(3): 221–223 (in Chinese).鄭欽岳, 麥凱, 潘祥福, 等. 商陸皂甙甲的抗炎作用. 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 1992, 6(3): 221–223.

[8] Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant, 1962, 15(3): 473–497.

[9] Edward K, Johnstone C, Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res, 1991, 19(6): 1349.

[10] Furner IJ, Huffman GA, Amasino RM, et al. AnAgrobacteriumtransformation in the evolution of the genusNicotiana. Nature, 1986, 319(6052): 422–427.

[11] Tanaka N, Hayakawa M, Mano Y, et al. Infection of turnip and radish storage roots withAgrobacterium rhizogenes. Plant Cell Rep, 1985, 4(2): 74–77.

[12] Veliky IA, Martin SM. A fermenter for plant cell suspension cultures. Can J Microbiol, 1970, 16(4): 223–226.

[13] Lai DW, Sun WJ. HPLC-ELSD determination of esculentoside A in different parts ofPhytolacca acinosaRoxb. andP.americanaL.. Chin J Pharm Anal, 2008, 28(9): 1466–1469 (in Chinese).賴道萬(wàn), 孫文基. HPLC-ELSD法測(cè)定商陸不同部位中商陸皂苷甲的含量. 藥物分析雜志, 2008, 28(9): 1466–1469.

[14] Li JL, Xu XL, Chen JS. Ri plasmid ofAgrobacterium rhizogenes and its application. Prog Biotechnol, 1993, 14(2): 8–14 (in Chinese).李集臨, 徐香玲, 陳金山. 發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒及其應(yīng)用. 生物工程進(jìn)展, 1993, 14(2): 8–14.

[15] Estell V, Frederiec D, Rajabir S, et al. Role of the host cell cycle in theAgrobacterium-mediated genetic transformation ofPetunia: evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta, 1997, 201(2): 160–172.

[16] Fu CX, Jin ZP, Yang R, et al. Establishment ofSaussurea involucratehairy roots culture and plantlet regeneration. Chin J Biotech, 2004, 20(3): 366–371 (in Chinese).付春祥, 金治平, 楊睿, 等. 新疆雪蓮毛狀根的誘導(dǎo)及其植株再生體系的建立. 生物工程學(xué)報(bào), 2004, 20(3): 366–371.

[17] Yang SH, Bi XX, Yang HJ. Induction ofEchinacean purpureahairy roots andin vitroculture. Chin Pharm J, 2011, 46(20): 1557–1562 (in Chinese).楊世海, 畢曉秀, 楊慧潔. 紫錐菊毛狀根誘導(dǎo)及離體培養(yǎng). 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2011, 46(20): 1557–1562.

[18] Peng CX, Zhang M, Liu QF, et al. Study on the hairy root induced fromDatura tatulaL. and production of gastrodin through suspension culture of hairy roots. J Yunnan Agric Univ, 2008, 23(4): 492–497 (in Chinese).彭春秀, 張梅, 劉慶豐, 等. 曼陀羅毛狀根的誘導(dǎo)及其懸浮培養(yǎng)合成天麻素初探. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 23(4): 492–497.

[19] David C, Chilton MD, Tempé J. Conservation of T-DNA in plants regenerated from hairy root cultures. Nat Biotechnol, 1984, 2(1): 73–76.

[20] Hadfi K, Batschaver A.Agrobacterium-mediated transformation of white mustard (Sinapis albaL) and regeneration of transgenic plants. Plant Cell Rep, 1994, 13(3/4): 130–134.

[21] David C, Petit A, Tempé J. T-DNA length variability in mannopine hairy root: more than 50 kinobase pairs of pRi T-DNA can integrate in plant cells. Plant Cell Rep, 1988, 7(2): 92–95.

[22] Amselem J, Tepfer M. Molecular basis for novel root phenotypes induced byAgrobacterium rhizogenesA4 on cucumber. Plant Mol Biol, 1992, 19(3): 421–432.

[23] Shi HP, Li L, Pan RC. Genetic transformation ofCucumis sativusbyAgrobacterium rhizogenes. Acta Botan Sin, 1998, 40(5): 470–473 (in Chinese).施和平, 李玲, 潘瑞熾. 發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化. 植物學(xué)報(bào), 1998, 40(5): 470–473.

[24] Xie D, Ye HC, Li GF, et al. Selection of hairy root clones ofArtemisia annuaL. for artemisinin production. Israel J Plant Sci, 2001, 49(2): 129–134.

[25] Jouanin L, Guerche P, Panboukdjian N, et al. Structure of T-DNA in plants regenerated from roots transformed byAgrobacterium rhizogenesstrain A4. Mol Gen Genet, 1987, 206(3): 387–392.

[26] Wang CZ, Ding JY. Effects of different media and phytohormones on the growth and ginsenoside content ofPanax quinquefoliumL. hairy root. J Plant Resour Environ, 2001, 10(4): 1–4 (in Chinese).王沖之, 丁家宜. 不同培養(yǎng)基及外源激素對(duì)西洋參毛狀根的生長(zhǎng)和皂甙含量的影響. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào), 2001, 10(4): 1–4.

[27] Sun BX, Yang GX, Wang QL, et al. Study onPanax ginsenghairy root and glycoside production. Chin Trad Patent Med, 2003, 25(9): 746–748 (in Chinese).孫彬賢, 楊光孝, 汪沁琳, 等. 人參毛狀根合成人參皂苷培養(yǎng)條件的優(yōu)化. 中成藥, 2003, 25(9): 746–748.

[28] Zhang YL, Song JY, Lv GL, et al. Establishment of hairy root culture ofSalvia miltiorrhizaBunge and its production of tanshinones. China J Chin Mater Med, 1995, 20(5): 269–271 (in Chinese).張蔭麟, 宋經(jīng)元, 呂桂蘭, 等. 丹參毛狀根培養(yǎng)的建立和丹參酮的產(chǎn)生. 中國(guó)中藥雜志, 1995, 20(5): 269–271.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Factors influencing induction andin vitroculture of hairy roots inPhytolacca americanaL.

Heping Shi1, Yuanfeng Zhu1, Po Keung Eric Tsang2, Cheuk Fai Stephen Chow2, Zhen’ao Yu1, and Shengqin Huang1
1Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development,College of Life Science,South China Normal University,Guangzhou510631,Guangdong,China
2Department of Science and Environmental Studies,the Hong Kong Institute of Education,New Territories,Hong Kong,China

To use hairy roots for producing medicinal ingredients ofPhytolacca americanaL.we studied the factors influencing the induction andin vitroculture. Hairy roots could be incited from the veins of cut surface (morphological lower) ofP. americanaL.leaf explants around 18 days after infection with the strain ofAgrobacterium rhizogenesATCC15834. The highest rooting rate, 70%, was obtained when leaf explants were pre-cultured for 1 day, infected for 20 min, and co-cultured for 4 days. The transformation was confirmed by PCR amplification ofrolC of Ri plasmid and silica gel thin-layer chromatography of opines fromP. americanaL. hairy roots.All the hairy root lines could grow rapidly on solid exogenous phytohormone-free MS medium. Among the 9 hairy root lines, the hairy root line 2 had most rapid growth, most branched lateral roots and most intensive root hair; the root surface of some hairy root lines seemed purple or red, while that of the other hairy root line appeared white. Among liquid media MS, 1/2MS, B5 and 6,7-V tested, the best growth for hairy root lines was attained in liquid exogenous phytohormone-free MS medium. Compared with exogenous phytohormone-free MS medium, 6,7-V medium was better for synthesis and accumulation of esculento side A in hairy roots. The established optimal conditions for induction andin vitroculture ofP. americanahairy roots had laid an experimental and technological foundation for production of medicinal constituents esculento side A from large scale culture of hairy roots.

Phytol accaamericanaL.,Agrobacterium rhizogenes, hairy roots, esculento side A

s:Heping Shi. Tel: +86-20-85214793; E-mail: shihp@scnu.edu.cn

Received:September 15, 2016;Accepted:November 30, 2016

Supported by:Committee of Science and Technology in Guangdong Province, China (No. 2011B020304006).

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目 (No. 2011B020304006) 資助。