毒死蜱對(duì)大鼠生精細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響

趙長瑤，吳焱森，吳 婧，周曉娟 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

毒死蜱對(duì)大鼠生精細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響

趙長瑤，吳焱森，吳 婧，周曉娟 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

目的：探討毒死蜱對(duì)大鼠睪丸生精細(xì)胞增殖及相關(guān)因素的影響。方法：SD大鼠30只隨機(jī)分為3組，對(duì)照組、低劑量0.8mg/(kg·d)和高劑量8.0mg/(kg·d)染毒組，28d后觀察大鼠體質(zhì)量、睪丸臟器系數(shù)變化，采用免疫組化SP法檢測(cè)睪丸生精細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)。結(jié)果：低、高劑量染毒組體質(zhì)量分別為(278.86±20.47)、(244.80±21.18)g，低于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；生精細(xì)胞PCNA增殖指數(shù)PI分別為(22.66±2.59)%、(14.26±2.31)%，均低于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)論：毒死蜱可降低生殖細(xì)胞PCNA的表達(dá)，對(duì)雄性生殖系統(tǒng)造成損害。

毒死蜱；生精細(xì)胞；增殖細(xì)胞核抗原

毒死蜱(chlorpyrifos，CPF)是一種殺蟲譜廣、低毒高效的有機(jī)磷農(nóng)藥，其全球銷售額占有機(jī)磷農(nóng)藥第一位。近年來有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和機(jī)體的危害日益引起人們的重視。美國國家癌癥研究機(jī)構(gòu)2004年報(bào)道CPF與肺癌的發(fā)生有關(guān)[1]。同時(shí)CPF作為一種可疑的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，其內(nèi)分泌干擾作用問題令人們十分關(guān)注。國內(nèi)有研究表明CPF可以引起大鼠精子數(shù)目減少，精子活動(dòng)度下降，精子畸形率增加等生精功能障礙[2]，但其確切的分子機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過研究一定劑量的CPF對(duì)大鼠生殖細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)的影響，以探討CPF對(duì)生精功能的影響，為進(jìn)一步闡明CPF的雄性生殖毒性的可能機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物分組及染毒方法 30d齡健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量55～65g，長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.1.2試劑 毒死蜱原藥(純度99%，湖北沙隆達(dá)股份有限公司產(chǎn)品)；溶劑為市售精制玉米油；PCNA免疫組化試劑盒(北京中心生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及染毒方法 霍恩氏法確定CPF對(duì)SD大鼠的LD50值。將大鼠隨機(jī)平均分為3組，分別為(溶劑)對(duì)照組、CPF低濃度0.8mg/(kg·d)組、CPF高濃度8mg/(kg·d)組。所有動(dòng)物均以玉米油作為溶劑，腹腔注射染毒，自由飲食，飼料中不含豆餅，染毒28d(2個(gè)生精周期)后處死。

1.2.2檢測(cè)指標(biāo) ①大鼠體質(zhì)量、睪丸稱重并計(jì)算臟器系數(shù)。處死大鼠后剖腹暴露睪丸，分離系膜及周圍脂肪，切除睪丸，立即稱濕重并計(jì)算臟器系數(shù)。公式：臟器系數(shù)(%)=臟器濕重(g)/體質(zhì)量(g)×100%。②稱重后取大鼠一側(cè)睪丸，常規(guī)方法固定、包埋、切片、脫蠟，3%的H2O2室溫孵育15min，PBS清洗后熱修復(fù)10min。正常山羊血清封閉，室溫孵育10min，滴加1∶150稀釋的PCNA單克隆抗體，4℃過夜。PBS清洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗孵育10min，辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素37℃孵育15min。PBS清洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，透明，封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理每個(gè)睪丸組織隨機(jī)選擇10個(gè)垂直切面的生精小管，以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)PCNA表達(dá)陽性生精細(xì)胞數(shù)各占總生精細(xì)胞數(shù)的比例，即增殖指數(shù)(PI)。采用SPSS10.0軟件進(jìn)行方差分析。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1染毒對(duì)大鼠體質(zhì)量、睪丸重量及其臟器系數(shù)的影響見表1。結(jié)果顯示染毒組的大鼠體質(zhì)量增長緩慢，染毒組的睪丸臟器系數(shù)與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)，臟器系數(shù)呈上升趨勢(shì)。

2.2染毒對(duì)大鼠PCNA表達(dá)的影響見表2。結(jié)果顯示各組大鼠均可見PCNA陽性表達(dá)的生精細(xì)胞，主要見于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞，圓形精子細(xì)胞少量表達(dá)，精子不表達(dá)。各染毒組生精細(xì)胞PI與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)，且PI值呈下降趨勢(shì)。

表1 各組大鼠體重、睪丸重量及其臟器系數(shù)的比較

注：與對(duì)照組、低劑量組比較，＊Plt;0.05。

表2 各組大鼠生精細(xì)胞PCNA增殖指數(shù)的比較

注：與對(duì)照組、低劑量組比較，＊Plt;0.05。

3 討 論

睪丸正常生精過程即從精原細(xì)胞到精子形成的連續(xù)增殖分化過程，包括精原干細(xì)胞的增殖分化、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和精子形成三個(gè)階段。在此過程中，精子發(fā)生對(duì)外來有害因素的作用非常敏感，環(huán)境化學(xué)物可在不同階段干擾精子的正常發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨CPF染毒劑量的增加，大鼠體質(zhì)量增長減慢，且睪丸臟器系數(shù)與對(duì)照組比較顯著升高，這與國內(nèi)學(xué)者研究結(jié)果基本一致[2]。表明CPF對(duì)雄性生殖器官具有一定毒性作用，可能影響睪丸的正常精子發(fā)生過程。

PCNA基因表達(dá)是細(xì)胞DNA復(fù)制、細(xì)胞增殖的一個(gè)標(biāo)志。PCNA作為DNA聚合酶δ的輔助蛋白，具有協(xié)同DNA前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成，為DNA復(fù)制起始所必須，具有維持DNA多聚酶活性的作用。PCNA含量變化在細(xì)胞增殖中有明顯周期性，與DNA合成密切相關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)觀察到PCNA在生精細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，且主要見于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞，而精子不表達(dá)。這是由于處于有絲分裂期的精原細(xì)胞和減數(shù)分裂期的精母細(xì)胞中有DNA合成，而精子已停止細(xì)胞分裂，無明顯DNA合成。本研究結(jié)果顯示CPF染毒時(shí)生精細(xì)胞的PCNA表達(dá)減弱，且隨染毒濃度加大，PI值顯著減低。

CPF對(duì)生殖細(xì)胞增殖能力的影響可能是一個(gè)多途徑、多因素的過程。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明CPF對(duì)雄性生殖器官產(chǎn)生毒性作用，可能是通過一定途徑影響PCNA的表達(dá)，使生精細(xì)胞多聚酶活力下降，生殖細(xì)胞增殖能力下降，干擾精子的正常生長和發(fā)育過程，其具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

[1]lavanja MCR， Dosemeci M， Samanic C，etal.Pesticides and lung cancer risk in the agricultural health study cohort[J]. Am J Epidemiol， 2004， 160(9)：876-885.

[2]文一，魏帥，潘家榮. 毒死蜱對(duì)雄性大鼠生精功能的影響[J]. 農(nóng)藥，2008，47(8)：595-597.

[3]Chieffi P， Nastic M，F(xiàn)ulgione D，etal. Expression of PCNA in the testis of lizard，Podarcis sicula:an endogenous molecular marker of mitotic germinal epithelium proliferation[J]. Zygote，2001，9：317-320.

[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.036

R99

A

1673-1409(2009)04-R075-02

2009-11-02

趙長瑤(1973-)，女，湖北荊州人，講師，從事醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)與研究工作。