天然氣庫土壤中細(xì)菌及甲烷氧化菌的數(shù)量分布特性研究

孔淑瓊 黃曉武 李 斌 詹 信 佘躍惠

(長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 荊州 434023)(長江大學(xué)城市建設(shè)學(xué)院，湖北 荊州 434023)(中石油西南油氣田分公司安全環(huán)保與技術(shù)監(jiān)督研究院,四川 成都 610213)(中國石油大學(xué)(北京)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102249)(長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 荊州 434023)

天然氣庫土壤中細(xì)菌及甲烷氧化菌的數(shù)量分布特性研究

孔淑瓊 黃曉武 李 斌 詹 信 佘躍惠

(長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 荊州 434023)(長江大學(xué)城市建設(shè)學(xué)院，湖北 荊州 434023)(中石油西南油氣田分公司安全環(huán)保與技術(shù)監(jiān)督研究院,四川 成都 610213)(中國石油大學(xué)(北京)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102249)(長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 荊州 434023)

在天然氣藏壓力的驅(qū)動(dòng)下，天然氣藏的輕烴氣體持續(xù)向地表做垂直擴(kuò)散和運(yùn)移，在油氣藏正上方的地表土壤中非常發(fā)育并形成微生物異常，研究這種異常現(xiàn)象可作為地下輕烴滲漏的指標(biāo)，對這種高度專屬性細(xì)菌的檢測可為判別土壤中是否存在甲烷提供依據(jù)。通過運(yùn)用傳統(tǒng)的稀釋涂平板方法對天然氣庫的0.5m、1.0m、1.5m和2.0m深度土層中微生物數(shù)量計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，同一采樣點(diǎn)位土壤中的細(xì)菌數(shù)量隨著土層的加深而逐漸減少,0.5m淺層土壤中微生物的數(shù)量級在107，1m、1.5m和2m土層土壤中微生物的數(shù)量級在106、105和104；甲烷氧化菌的數(shù)量分布規(guī)律與此基本相同，0.5m淺層土壤中甲烷氧化菌的數(shù)量級在105，1m、1.5m和2m土層土壤中甲烷氧化菌的數(shù)量級在104、104和103。與對照點(diǎn)對比可知，天然氣庫土壤中出現(xiàn)了“微生物異?！狈植?，這種異常分布對評價(jià)和預(yù)測下伏天然氣藏的存在和性質(zhì)具有直接的現(xiàn)實(shí)意義。

天然氣庫土壤；甲烷氧化菌；數(shù)量分布；微生物異常

天然氣(Natural Gas)是一種重要的能源，它是埋藏在地下的古生物經(jīng)過億萬年的高溫和高壓等作用而形成的可燃?xì)?，其主要成分為甲烷，還含有少量的乙烷、丁烷等。在天然氣藏壓力的驅(qū)動(dòng)下，天然氣藏的輕烴氣體持續(xù)向地表做垂直擴(kuò)散和運(yùn)移，土壤中的專性微生物以輕烴氣體作為其唯一能量來源。在油氣藏正上方的地表土壤中非常發(fā)育并形成微生物異常[1]。

甲烷氧化菌是烴氧化菌群中的一種，它們是一類具有高度專一的利用碳一化合物的細(xì)菌群體[2]。由于甲烷的存在，參與生物的生命活動(dòng)，故甲烷氧化菌普遍存在于土壤中。微生物甲烷氧化作用首先是通過甲烷加氧酶的作用活化甲烷，在有氧存在的條件下生成甲醇，進(jìn)一步氧化可生成甲醛。甲醛可直接被同化產(chǎn)生生物質(zhì)或被氧化成CO2并產(chǎn)生能量[3]。由于這種細(xì)菌的高度專屬性，可以將甲烷氧化菌從其它細(xì)菌中分離出來并加以分析。對這些高度專一化細(xì)菌的成功鑒別提供了土樣中存在甲烷的一定指示作用。因此，在含甲烷天然氣的天然或人工氣苗附近，甲烷氧化菌類別和數(shù)量大大增加，即在含油氣區(qū)輕烴受細(xì)菌氧化的強(qiáng)度越大,就越有可能發(fā)現(xiàn)油氣田[4]。甲烷氧化菌是為識別石油聚集體位置而研究的第一類細(xì)菌。在不存在纖維素氧化菌的情況下，土壤中的甲烷氧化菌可作為指示地下滲漏輕烴的指標(biāo)[5]。對這種高度專屬性細(xì)菌的檢測可為判別土壤中是否存在甲烷提供依據(jù)。

1 材料和試劑

1.1土壤樣品的采集

土壤樣品采集點(diǎn)位于大港油田天然氣庫上方土壤，大港油田天然氣庫地理位置圖如圖1所示，布設(shè)采樣點(diǎn)平面示意圖如圖2中所示。在天然氣庫軸線A-B斷面上共取5個(gè)點(diǎn)(其中5號點(diǎn)位為對照點(diǎn)位)，每個(gè)點(diǎn)位在縱向剖面上取0.5、1、1.5、2m深度的土壤樣品。采集微生物土壤樣品的關(guān)鍵是保持樣品不受污染，確保所采土樣從所要求的深度內(nèi)采集。采樣層必須為氧化帶，位于地下水位以上。每個(gè)樣品重約100g，然后用消毒過的采樣袋進(jìn)行密封，最后送至實(shí)驗(yàn)室在4～8℃溫度條件下保存。采得的土壤樣品為深淺略有不同的黃色，亞粘土，含有一定的濕度。土壤鹽堿性較大，土壤肥力不高，植物生長很少。

圖1 大港天然氣儲(chǔ)氣庫地理位置圖 圖2 土壤采樣點(diǎn)位平面示意圖

1.2儀器和試劑

1)儀器 立式壓力蒸汽滅菌鍋：LS-B50L；電子天平：BS124S；恒溫?fù)u床：THZ-C-1；生化培養(yǎng)箱：LRH-250；生化冷藏冰箱：BCD-2158H。

2)試劑 純甲烷氣體購于北京天佑順氣體公司，純度為99.99%。其他試劑均為化學(xué)純等級以上的化學(xué)試劑。

1.3培養(yǎng)基

1)普通細(xì)菌培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基) 牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、蒸餾水1000ml、瓊脂18g，調(diào)節(jié)pH到7.2[6]。

2)甲烷氧化菌的MPN計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(甲烷氧化菌培養(yǎng)基) KH2PO41.0g/L、Na2HPO4·12H2O 2.9g/L、MgSO4·7H2O 0.32g/L、(NH4)2SO43.0g/L,礦質(zhì)元素溶液[7]10ml，蒸餾水990ml,pH值為6.8。

3)固體培養(yǎng)基 上述培養(yǎng)基中加2%的瓊脂。

2 試驗(yàn)方法

2.1土壤中細(xì)菌總數(shù)量的計(jì)數(shù)

采用稀釋涂布的平板計(jì)數(shù)法，分別對0.5、1.0、1.5和2.0m的4個(gè)土層深度土壤進(jìn)行梯度稀釋處理后接種計(jì)數(shù)。具體操作方法如下：取10g左右的土壤, 去雜質(zhì)混勻, 然后稱取5g土樣加入裝有45ml的無菌生理鹽水的100ml血清瓶中, 振蕩10min，以10倍系列稀釋法將土樣懸液系列稀釋至10-1、10-2、10-3、…、10-8個(gè)連續(xù)的稀釋度，將系列稀釋土壤懸液分別接種到裝有4.5ml滅菌的普通細(xì)菌液體培養(yǎng)基試管中，每管接種土壤懸液0.5ml，每個(gè)稀釋度重復(fù)接種3管，同時(shí)設(shè)置不接種的對照。取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8相應(yīng)稀釋度的土壤懸液0.1ml分別涂布于培養(yǎng)基固體平板，30℃條件培養(yǎng)1～2d后計(jì)數(shù)，菌落數(shù)在10～100以內(nèi)試管作為計(jì)數(shù)試管，記錄計(jì)數(shù)結(jié)果。

2.2甲烷氧化菌的滾管法計(jì)數(shù)

采用滾管法測定土樣中的甲烷氧化菌的種群數(shù)量，具體操作如下：配制甲烷氧化菌的MPN(Most Portable Number，最大似然計(jì)數(shù))計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配制后，分裝于厭氧試管中，每支裝4.5ml，然后用異丁基橡膠塞密封，以備加入甲烷氣體，高壓滅菌。分別取0.5ml 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的土樣稀釋液，接種于3支裝有4.5ml已融化的45～50℃甲烷氧化菌固體培養(yǎng)基中(溫度采用恒溫水浴鍋控制)，立即滾管，每個(gè)稀釋度重復(fù)接種3 管，同時(shí)設(shè)置不接種的對照，然后每支試管中加入5ml甲烷氣體，在30℃恒溫培養(yǎng)7d，計(jì)數(shù)試管內(nèi)菌落的數(shù)量，記錄計(jì)數(shù)結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1土壤中的細(xì)菌總數(shù)量分布

按照上述細(xì)菌總數(shù)量的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 土壤中細(xì)菌總數(shù)量計(jì)數(shù)結(jié)果(CFU/g)

從土壤中細(xì)菌總數(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果中可以看出，對同一采樣點(diǎn)不同深度的土壤，表層土壤中數(shù)量最大，隨著深度的增加，細(xì)菌總數(shù)量逐漸減少。土壤深度每增加0.5m，細(xì)菌總數(shù)量減少約一個(gè)數(shù)量級。0.5m比1.0m處土壤中細(xì)菌數(shù)量高一個(gè)數(shù)量級，1.5m和2.0m土層中細(xì)菌數(shù)量差別也有一個(gè)數(shù)量級。這主要是由于土壤表層含氧量高，同時(shí)，土壤表層溫度和通氣狀況利于微生物的生存與繁衍，因而土壤細(xì)菌數(shù)量表層最大，而隨著土層的加深，土壤養(yǎng)分結(jié)構(gòu)、水分、溫度，通氣狀況趨于穩(wěn)定，造成了底層的細(xì)菌數(shù)量顯著減少。

在天然氣庫同一深度處的不同采樣點(diǎn)，細(xì)菌數(shù)量基本在同一數(shù)量級，對照點(diǎn)位D5處細(xì)菌總數(shù)量與其他點(diǎn)位差別不大，但位于天然氣庫正上方的D2采樣點(diǎn)數(shù)目明顯比其他點(diǎn)位多出幾倍，而D2采樣點(diǎn)處天然氣庫的深度最大，這反映了細(xì)菌的總量可能與天然氣在土壤中的含量正相關(guān)，說明微生物中具有大量與天然氣有關(guān)的細(xì)菌類群。

從天然氣庫土壤中細(xì)菌總數(shù)量的縱向和橫向分布中可以看出，細(xì)菌總數(shù)量隨土壤深度增加而逐漸減少，并且隨著土壤中天然氣的水平含量增加而增加。這可以對天然氣庫的下伏地理位置指明范圍，為天然氣的微生物勘探提供理論基礎(chǔ)。

3.2土壤中甲烷氧化菌的數(shù)量

按照上述甲烷氧化菌的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)結(jié)果如下表2所示。

表2 土壤中甲烷氧化菌數(shù)量計(jì)數(shù)結(jié)果(CFU/g)

從土壤中甲烷氧化菌的計(jì)數(shù)結(jié)果可以看出，同一采樣點(diǎn)不同深度的土壤，表層土壤中甲烷氧化菌的數(shù)量最大，隨著土壤深度的增加，甲烷氧化菌的數(shù)量逐漸減少，甲烷氧化菌的數(shù)量變化在6.3×105～2.9×102CFU/g土壤之間，0.5m比1.0m深度處的土壤中的甲烷氧化菌數(shù)量高一個(gè)數(shù)量級，比2.0m深度處的土壤中甲烷氧化菌的數(shù)量高2個(gè)數(shù)量級。這主要是由于土壤表層含氧量高，同時(shí)土壤表層溫度和通氣狀況有利于甲烷氧化菌的生存與繁衍，因而甲烷氧化菌的數(shù)量表層最大。天然氣庫上方土壤中的甲烷氧化菌數(shù)量可達(dá)到105數(shù)量級，而對照點(diǎn)位D5基本在102數(shù)量級，這說明了在天然氣庫土壤中出現(xiàn)了“微生物異?！薄?/p>

在天然氣庫相同深度的不同采樣點(diǎn)，甲烷氧化菌數(shù)量有所差別，D2采樣點(diǎn)數(shù)目明顯比其他點(diǎn)位多出幾倍，而D2采樣點(diǎn)處天然氣的深度最大，這也反映了甲烷氧化菌的數(shù)量與天然氣在土壤中的含量正相關(guān)，而對照點(diǎn)位D5處甲烷氧化菌的數(shù)量明顯很少，這些都說明甲烷氧化菌的數(shù)目分布與天然氣含量直接相關(guān)。

從天然氣庫土壤中甲烷氧化菌數(shù)量的縱向和橫向分布中可以看出，甲烷氧化菌的數(shù)量隨土壤深度增加而逐漸減少，并且隨著土壤中天然氣的水平含量增加而明顯增加。這可以預(yù)測下伏天然氣藏的存在，能指明天然氣庫的下伏地理位置范圍，并且能反映天然氣庫的相對埋深深度，這種“微生物異?！爆F(xiàn)象對微生物勘探天然氣具有重大的指示意義。

4 結(jié) 論

1)同一采樣點(diǎn)土壤不同土層中細(xì)菌數(shù)量相比較，表層土壤中數(shù)量最多，并且隨著土層的加深，數(shù)量逐漸減少。

2)在天然氣庫不同采樣點(diǎn)同一深度處，對照點(diǎn)位處細(xì)菌總數(shù)量與其他點(diǎn)位的微生物數(shù)量處于同一數(shù)量級。在D2點(diǎn)位處細(xì)菌的量比其他點(diǎn)位明顯要高。

3)同一采樣點(diǎn)土壤不同深度土層中甲烷氧化菌的數(shù)量相比較，表層土壤中數(shù)量最大，并且隨著土層的加深，數(shù)量逐漸減少。

4)在天然氣庫不同采樣點(diǎn)位處，甲烷氧化菌數(shù)量有所差別，尤其是天然氣庫深度最大處甲烷氧化菌數(shù)量最大，而對照點(diǎn)位處甲烷氧化菌的數(shù)量明顯很少。

5)綜合細(xì)菌數(shù)量的垂向分布和水平分布以及甲烷氧化菌的垂向分布和水平分布規(guī)律得知，在天然氣庫土壤中會(huì)出現(xiàn)“微生物異常”，這種異常現(xiàn)象可以用做檢測和預(yù)測下伏油氣藏的存在。

[1]易紹金,佘躍惠.石油與環(huán)境微生物技術(shù)[M].武漢:中國地質(zhì)大學(xué)出版社, 2002.

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[編輯] 洪云飛

TE132.1

A

1673-1409(2009)03-N056-04

2009-05-20

中國石油天然氣股份公司創(chuàng)新基金項(xiàng)目(07E1025)。

孔淑瓊(1981-)，女，2002年大學(xué)畢業(yè)，碩士，講師，現(xiàn)主要從事環(huán)境科學(xué)與工程方面的教學(xué)與研究工作。