氨萘菲特類似物光譜性能和抗腫瘤機(jī)制研究

吳愛斌

(長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434023)

氨萘菲特類似物光譜性能和抗腫瘤機(jī)制研究

吳愛斌

(長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434023)

通過紫外光譜、熒光光譜和流式細(xì)胞技術(shù)研究了一系列新型的氨萘菲特類似物5a-c的光譜性能及其抗腫瘤作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，化合物5a-c表現(xiàn)為中等強(qiáng)度的DNA嵌入劑，該系列化合物能有效地引起HL-60細(xì)胞周期阻滯并誘導(dǎo)凋亡。該工作為深入理解化合物5a-c獨(dú)特的抗腫瘤活性提供了一定的化學(xué)生物學(xué)證據(jù)，并為其結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步修飾和抗腫瘤性能的進(jìn)一步優(yōu)化提供了指導(dǎo)。

氨萘菲特；ctDNA；光譜；HL-60；抗腫瘤

萘酰亞胺類抗腫瘤藥物是抗腫瘤藥物發(fā)展中極其重要的一部分，受到人們廣泛關(guān)注[1,2]。該類化合物具有平面、剛性、多環(huán)發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)，分子的稠環(huán)部分可以嵌入到DNA雙螺旋堿基對之間，引起DNA雙螺旋的拉伸、解旋和僵化。由于改變了DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，導(dǎo)致在生化水平上DNA的功能發(fā)生了封鎖(如DNA聚合酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性受到抑制等)而發(fā)揮藥效[3]。該藥物分子表面緊緊地挨著DNA堿基對的芳香雜環(huán)，在雙螺旋鏈中以π-π共軛、偶極-偶極相互作用而使電荷分布達(dá)到穩(wěn)定[4]。這些作用可以通過一些光譜現(xiàn)象(如紫外減色、熒光淬滅、1H-NMR化學(xué)位移高場移動(dòng)等)來說明[5]。

圖1 氨萘菲特類似物5a-c的結(jié)構(gòu)

筆者曾報(bào)道了具有較好抗腫瘤活性的氨萘菲特類似物5a-c(圖1)[5]，其對6種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性(IC50值)達(dá)到了μm數(shù)量級。下面，筆者主要通過UV(紫外光譜)、FL(熒光光譜)和FACS(流式細(xì)胞分析)等方法對該類化合物的光譜性能和抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行研究，為理解其獨(dú)特的抗腫瘤性質(zhì)提供了一定的化學(xué)生物學(xué)證據(jù)，并對其結(jié)構(gòu)和性能的進(jìn)一步優(yōu)化提供指導(dǎo)。

1 試驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

BS-210S萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)；PGENERAL TU-1901紫外-可見光譜儀；Hitachi F-4500熒光光譜儀；FACScalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)流式細(xì)胞儀，Modifit’s program(Becton Dickinson)自動(dòng)分析細(xì)胞周期分布；ctDNA購于Sigma Aldrich公司；緩沖溶液為二次水配制。

1.2ctDNA溶液的制備

精確稱量高度聚合的ctDNA溶解于10mm Tris-HCl、1mm EDTA、pH=7.5的緩沖溶液中。該溶液在260和280nm處紫外吸收的比值為1.8～1.9∶1，表明DNA充分從蛋白中游離出來，可以用于測試。通過Beer定律，計(jì)算出儲備液濃度c(A=εcl，A、ε為紫外260nm處的吸光度和摩爾消光系數(shù)，ε=6600M-1；l為樣品池的長度，一般取1cm)，并在4℃冰箱中至少平衡4d后使用[6]。

1.3樣品溶液的制備

精確稱量合成的目標(biāo)化合物5a-c分別溶解于10ml DMSO(重蒸)中，配制成10-3M的儲備液，用于FACS測試；吸取一定量的儲備液用不同溶劑稀釋，得到不同溶劑溶解的樣品溶液，濃度為10-5M(DMSO含量lt;1%)，用于光譜測定。

1.4ctDNA滴定

分別配制化合物和ctDNA的濃度為10 μM和0～180μM的20mm Tris-HCl、50mm NaCl(pH7.5)、DMSO(lt;1% by volume)的緩沖溶液，溶液最終體積為10ml。該溶液于25℃在暗箱中連續(xù)振蕩平衡6h后進(jìn)行光譜測定。根據(jù)非線性方程[7]:

可以得到化合物與DNA結(jié)合常數(shù)Ka。其中，I0、I和I∞分別表示單獨(dú)嵌入劑、嵌入劑與一定濃度DNA以及DNA飽和后嵌入劑的熒光強(qiáng)度；[DNA]0和[Q]0則分別表示DNA與嵌入劑的初始濃度。

1.5熒光量子產(chǎn)率的計(jì)算

以硫酸奎寧(ΦF= 0.58)為基準(zhǔn)[8]，根據(jù)公式:

Φ(sample)=Φ(standard)×[A(standard)×S(sample)]/[A(sample)×S(standard)]

計(jì)算，式中Φ(sample)、Φ(standard)分別表示待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)物的熒光量子產(chǎn)率；A(sample)、A(standard)分別表示待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)物在激發(fā)波長下的吸光度；S(sample)、S(stabdard)分別表示待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)物的熒光發(fā)射峰面積。

1.6細(xì)胞周期分布測試

HL-60細(xì)胞與不同濃度的化合物培養(yǎng)一定時(shí)間后，于離心機(jī)中離心5min(1000rpm)，去除上層清液。細(xì)胞用PBS液清洗2次，用300μl PBS液和700μl 75%冰冷的乙醇固著過夜。室溫下離心(1000rpm)收集固著細(xì)胞。將細(xì)胞重新懸浮于1ml PBS(100μl/1×105cells)中，加入0.5μl RNase A于37℃培養(yǎng)30min。加入碘化丙錠(50μg/ml)將DNA染色，用FACScalibur儀(Becton Dickinson, San Jose, CA)分析大約20000個(gè)固著細(xì)胞，用Modifit’s程序(Becton Dickinson)自動(dòng)分析細(xì)胞周期分布[9]。

2 結(jié)果和討論

2.1紫外和熒光性質(zhì)

以硫酸喹啉(0.1mol/L sulfuric acid,Φ=0.58)作為標(biāo)準(zhǔn)物[8]，測量了這些化合物在二氯甲烷、乙腈、乙醇、Tris-HCl(pH = 7.5)和HEPES(pH = 7.2)不同溶劑中的紫外吸收以及熒光光譜。從表1可以看到，隨著溶劑極性的增加，化合物的最大吸收和發(fā)射發(fā)生一定程度的紅移，呈現(xiàn)較小的正向溶劑化效應(yīng)，其吸收強(qiáng)度變化不大，而熒光量子效率卻顯著降低。而且，不同的芳基取代基對熒光光譜也產(chǎn)生較大的影響，當(dāng)取代基為磺胺基時(shí)，化合物的熒光量子產(chǎn)率相對較高。值得注意的是，化合物5a-c在緩沖溶液中的量子產(chǎn)率明顯高于其在乙醇中的量子產(chǎn)率，這是因?yàn)镹,N-二甲基氨基上的叔胺N原子在緩沖體系中被質(zhì)子化而抑制PET(photo-induced electron transfer)過程發(fā)生，從而使得熒光得以部分恢復(fù)[10]。

表1 目標(biāo)化合物在不同溶劑中的光譜性質(zhì)

2.2ctDNA結(jié)合性質(zhì)

化合物的細(xì)胞毒性和它與DNA相互作用能力有一定關(guān)聯(lián)。嵌入作用是藥物同DNA作用的一種方式，一般芳香化合物都是以這種方式同DNA作用的。這種模型不僅僅被NMR等分析證明，還有30多個(gè)小分子與寡聚核甘酸的嵌入復(fù)合物晶體經(jīng)X-射線衍射而確定[11,12]。因此，嵌入模式已被廣泛接受。當(dāng)熒光化合物嵌入到DNA的堿基對之間，其熒光強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)或減弱，并且變化的強(qiáng)度與DNA形成復(fù)合物的量成正比，其表觀結(jié)合常數(shù)Ka可由DNA濃度與熒光變化的關(guān)系式通過非線性擬合計(jì)算得到[7]。

代表性化合物5a和5c的滴定曲線如圖2和圖3所示。隨著ctDNA的加入，化合物的光譜發(fā)生一定程度的變化，紫外光譜發(fā)生輕微的紅移(5a：1～5nm；5c：1～3nm)和明顯的減色現(xiàn)象(5a：56.2%～68.5%；5c：12.8%～57.6%)；熒光光譜則明顯地淬滅(5a：76.7%；5c：63.5%)，其表觀結(jié)合常數(shù)分別為1.29×106、4.92×104m-1。光譜測試表明該類化合物與DNA之間為經(jīng)典的嵌入結(jié)合模式，且為中等強(qiáng)度的嵌入劑[13, 14]。很明顯，化合物5a與DNA的結(jié)合能力強(qiáng)于5c，但與其細(xì)胞毒性之間沒有明顯地相關(guān)性。

圖2 化合物5a的ctDNA滴定曲線

圖3 化合物5c的ctDNA滴定曲線

圖4 化合物5a-c的流式細(xì)胞圖

2.3流式細(xì)胞分析

為了研究所合成的目標(biāo)化合物可能的抗腫瘤作用機(jī)制，筆者通過流式細(xì)胞技術(shù)(Fluorescence Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS)研究了它們對細(xì)胞周期(Cell Cycle)所產(chǎn)生的影響[15, 16]。試驗(yàn)中使用HL-60細(xì)胞株，目標(biāo)化合物的測試結(jié)果列于圖4中。

從圖4中可以看出，目標(biāo)化合物5a-c明顯對HL-60的細(xì)胞周期產(chǎn)生影響(G1、S、G2/M相對應(yīng)的百分?jǐn)?shù)明顯發(fā)生變化)，引起細(xì)胞周期阻滯，并能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(sub-G1或G0的百分?jǐn)?shù)從0.72%增加到15.31%～22.58%)。具體表現(xiàn)為：化合物5a和5c表現(xiàn)出對HL-60細(xì)胞的G1、G2/M期最強(qiáng)的阻滯能力，其值分別為56.05%和27.66%；IC50濃度下，凋亡誘導(dǎo)能力最強(qiáng)的化合物為5b(22.58%)，化合物的凋亡誘導(dǎo)能力按b、c、a順序遞減變化，這表明芳基取代基的大小和構(gòu)型對化合物的凋亡誘導(dǎo)能力有著重要影響，例如化合物5c(19.67%)的促凋亡能力比5a(15.31%)強(qiáng)但比5b(22.58%)弱；且化合物的細(xì)胞毒性與其凋亡誘導(dǎo)性能之間并沒有顯著聯(lián)系。

3 結(jié) 語

筆者對氨萘菲特類似物5a-c的光譜性能及其抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行了研究，紫外和熒光光譜研究表明該類化合物為典型的ICT型分子；ctDNA滴定實(shí)驗(yàn)表明，化合物與DNA之間為經(jīng)典的嵌入結(jié)合模式，為中等強(qiáng)度的嵌入劑；流式細(xì)胞分析表明，化合物5a-c能明顯引起HL-60細(xì)胞周期阻滯，并強(qiáng)烈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該工作說明氨萘菲特類似物可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而呈現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性，有望成為具有高效凋亡誘導(dǎo)作用的新型抗腫瘤藥物的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)，用于進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計(jì)。

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[編輯] 洪云飛

O622.6

A

1673-1409(2009)03-N026-04

2009-05-27

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(90713026/C0508)。

吳愛斌(1973-)，男，1995年大學(xué)畢業(yè)，講師，博士生，現(xiàn)主要從事有機(jī)合成和應(yīng)用化學(xué)方面的教學(xué)與研究工作。