Runx3基因在肝癌手術前后血漿中異常甲基化檢測及臨床意義

張海元

(長江大學醫(yī)學院，湖北 荊州 434023)

Runx3基因在肝癌手術前后血漿中異常甲基化檢測及臨床意義

張海元

(長江大學醫(yī)學院，湖北 荊州 434023)

目的：研究肝細胞癌組織及手術前后外周血漿中Runx3基因啟動子區(qū)異常甲基化狀態(tài)，探討其在肝癌早期診斷及療效評估中的價值；方法：采用DNA甲基化特異性PCR(MSP)技術分別對肝癌患者腫瘤組織及相應血漿進行Runx3異常甲基化檢測。結果：在81例肝癌組織中，Runx3異常甲基化率為43.2%(35/81)，相應血漿中Runx3甲基化檢出率為39.5 %(32/81)，血漿中Runx3基因甲基化改變與腫瘤組織甲基化狀況顯著相關(Plt;0.05)；其中15例手術治療患者手術前組織及血漿中Runx3甲基化檢出率均為40%(6/15)，術后只有1例患者血漿中Runx3基因異常甲基化。結論：血漿Runx3基因異常甲基化檢測在肝細胞癌早期診斷及療效評估方面有一定應用價值。

肝細胞癌；Runx3基因；甲基化；手術； 血漿

原發(fā)性肝細胞癌(HCC)是常見的惡性腫瘤，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷對于肝癌的治療和預后意義重大。DNA甲基化改變發(fā)生在腫瘤形成的早期階段，許多抑癌基因啟動子區(qū)域的異常甲基化，能促進腫瘤發(fā)生，導致惡性表型[1]，因此抑癌基因甲基化異常有可能成為癌變的早期檢測指標[2]。Runx3(runt相關轉錄因子3)是一種新發(fā)現(xiàn)的定位于染色體1p36.1[3]的抑癌基因，其表達異常與人類多種消化道腫瘤的發(fā)生密切相關，據(jù)Xiao等[4]發(fā)現(xiàn)48.3%(30/62)的肝細胞癌組織中Runx3基因有高度甲基化。由于血漿甲基化總是與腫瘤細胞內(nèi)抑癌基因甲基化同時出現(xiàn)[5]，為此，本研究采用敏感的甲基化特異性PCR(MSP)方法研究肝細胞癌組織及手術前后血漿中Runx3甲基化狀態(tài)，探討血液檢測Runx3甲基化改變在肝癌患者早期診斷上的意義，為肝癌患者治療方案選擇及療效評估提供新的思路。

1 材料與方法

1.1標本來源肝細胞癌組織81例及相對應的癌旁正常組織取自湖北省腫瘤醫(yī)院和鄂州市中心醫(yī)院腫瘤科2005年2月至2007年5月手術切除標本，所選取的肝細胞癌患者術前均未實施放療或化療。同時收集術前外周血漿以及其中15例患者的術后第14～21d的外周血漿，-80℃儲存。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 ①組織DNA的提?。阂苑?氯仿抽提法提取組織DNA，經(jīng)紫外定量后于-20℃保存。②血漿中DNA的提取：參考文獻[6]取3.0ml血漿，加入約10ml DNA緩沖抽提液(140mmol/L Tris, 140mmol/L EDTA, 0.5% SDS),加入蛋白酶K至終濃度為100μg/ml, 放入37℃水浴振蕩過夜，然后用酚-氯仿抽提法提取DNA。

1.2.2亞硫酸氫鈉處理基因組DNA 參照甲基化特異性PCR方法[7]用亞硫酸氫鈉處理基因組DNA,用2.5倍體積預冷無水乙醇和2μl糖原(5mg/ml)沉淀DNA, -40℃過夜，然后用70%乙醇洗滌沉淀2次，干燥后用30μl TE或去離子水溶解，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3甲基化PCR(MSP) 設計兩對Runx3基因的甲基化引物和非甲基化引物(見表1)?？傮w積為30μl的反應液中含有DNA 5μl, 10×緩沖液3μl， 氯化鎂 2.5mmol/L,引物0.5μmol/L, dNTP 250μmol/L, Hotstar Taq 0.5μl。MSP反應條件：95℃ 15min, 95℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 30s,35個循環(huán)，72℃ 10min。

表1 Runx3基因引物設計

M:250bp梯度標準DNA分子量；m:甲基化；u:未甲基化；P：患者血漿；N：癌旁正常組織；T：肝癌組織；圖1 MSP法檢測肝細胞癌患者腫瘤組織及血漿中Runx3甲基化狀態(tài)

1.3統(tǒng)計學處理以χ2檢驗分析MSP方法檢測到的組織與血漿中Runx3基因甲基化效率，并對Runx3基因甲基化情況與腫瘤臨床分級、血管侵潤等臨床病理參數(shù)的相關性進行分析。統(tǒng)計學處理均采用SPSS11.5軟件完成。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1肝細胞癌患者腫瘤組織及血漿中Runx3甲基化狀態(tài)本研究采用MSP方法檢測了81例肝細胞肝癌患者癌組織、癌旁正常組織及其相對應的血漿Runx3甲基化狀況(典型圖片分別見圖1A、圖1B、圖1C)。在癌旁正常組織中，Runx3基因啟動子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)異常甲基化現(xiàn)象，而在肝細胞癌組織中，Runx3基因啟動子區(qū)域甲基化率占43.2 %(35/81)，在相對應的肝細胞癌患者血漿中，Runx3基因啟動子區(qū)域甲基化率占39.5 %(32/81)。分析81例肝細胞癌患者血漿與腫瘤組織中Runx3甲基化狀態(tài)(見表2)，發(fā)現(xiàn)血漿中Runx3甲基化改變與腫瘤組織甲基化狀況顯著相關(Plt;0.05)。

表2 肝細胞癌患者血漿與腫瘤組織中Runx3異常甲基化檢測結果 例

2.2Runx3甲基化狀況和臨床病理參數(shù)的關系分析肝細胞癌患者血漿與腫瘤組織中Runx3甲基化狀況和臨床病理參數(shù)的關系(見表3)。在肝細胞癌患者血漿及腫瘤組織中，Runx3甲基化頻率與患者年齡、腫瘤分級分期、腫瘤大小等病理參數(shù)無顯著相關性(Pgt;0.05)。

表3 肝細胞癌組織和血漿中Runx3基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)與臨床病理參數(shù)的關系

2.3手術前后血漿中Runx3基因異常甲基化狀況15例有成對手術前后血漿標本的肝癌根治手術患者中，檢出6例患者的腫瘤組織及相應的術前血漿存在Runx3基因啟動子區(qū)域異常甲基化，術前血漿Runx3異常甲基化狀態(tài)與腫瘤組織標本保持一致，甲基化率為40%(6/15)；術后第10～14d外周血漿中只有1例存在Runx3異常甲基化，另外5例轉陰。

3 討 論

Runx3基因是哺乳動物中Runx家族的進化基礎,為新近克隆的一種候選抑癌基因[8]，是TGF-β信號傳導通路的一個重要環(huán)節(jié)。據(jù)Song等[9]報道，原發(fā)性肝癌存在著嚴重的TGF-β信號轉導障礙,這說明Runx3基因可能在肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中是關鍵性的腫瘤抑制基因，其功能失活可導致TGF-β/SMADS信號通路削弱。許多研究表明，Runx3基因在胃癌、結腸癌等人類多種腫瘤中存在啟動子區(qū)域甲基化異常[3,10，11]，在肝癌中也有報道[4]，這是抑癌基因Runx3失活的主要機制。

本研究采用甲基化特異性PCR方法檢測了81例肝細胞癌組織及手術前后血漿中Runx3基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)，研究結果顯示，肝癌組織中Runx3異常甲基化率占43.2 %(35/81)，而相應血漿中異常甲基化率占39.5 %(32/81)，血漿與相應肝癌組織相比僅有3例標本未檢出Runx3基因異常甲基化，可能是由于腫瘤組織細胞尚無凋亡、壞死脫落或血液循環(huán)中來自肝細胞癌的腫瘤細胞量太少而低于MSP檢測范圍。在肝細胞癌的腫瘤組織Runx3基因甲基化陰性的病例中，在相應的血漿中均未檢測到Runx3基因甲基化異?，F(xiàn)象，這可說明血漿和腫瘤組織之間Runx3基因甲基化檢出率存在良好的相關性，利用MSP方法檢測肝細胞癌血漿及腫瘤組織中Runx3基因啟動子區(qū)域異常甲基化具有良好的特異性。在15例有成對手術前后血漿標本肝癌根治手術患者中，有6例患者的腫瘤組織和血漿中檢測出Runx3異常甲基化，而其中5例患者術后血漿中甲基化轉陰，此期間手術是唯一的影響因素，因此可認為Runx3基因異常甲基化改變是手術造成的。

本研究有潛在重要的臨床應用價值。由于肝細胞癌患者血漿樣本易于獲得，取樣過程簡單方便，極大減輕了患者身心負荷和經(jīng)濟壓力，而且檢測方法基于甲基化特異性PCR技術，利用患者血漿檢測肝細胞癌Runx3基因異常甲基化的靈敏度可達91.4%(32/35)，特異性為100%，因此在理論上特異性要優(yōu)于其它方案的外周血核酸標記的檢測，使之有良好的應用前景[12]。肝癌根治手術后第14～21天，術前檢測有血漿Runx3異常甲基化的患者大部分可以轉陰，未轉陰的病例多疑有腫瘤殘存，對這部分病例可繼續(xù)監(jiān)測與隨訪，因此血漿Runx3異常甲基化檢測可以很好的對手術等治療方案的療效進行評估。肝細胞癌患者組織內(nèi)發(fā)生異常甲基化的DNA可不斷釋放到外周血循環(huán)，并且在血循環(huán)中長期存在，由于血清甲基化總是與腫瘤組織甲基化同時出現(xiàn)[5]，故血清中Runx3基因異常甲基化的檢測為篩選肝細胞癌患者中新的標志物提供了新思路。

[1] Jones PA，Baylin SB. The fundmetal role of epigenetic events in cancer[J]. Nat Rev Genet，2002，3：415-428.

[2] Kang GH，Shim YH，Jung HY，etal.CpG island methylation in premalignant stages of gastric carcinoma [J]. Cancer Res，2001，61：2847-2851.

[3] Li QL，Ito K，Sakakura C，etal.Causal Relationship between the loss of Runx3 Expression and Gastric Cancer[J]. Cell，2002，109：113-124.

[4] Xiao WH，Liu WW. Hemizygous deletion and hypermethylation of RUNX3 gene in hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol，2004，10(3)：376-380.

[5] Lee TL，Leung WK，Chan MW，etal.Detection of gene promoter hypermethylation in the tumor and serum of patients with gastric carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2002，8(6)：1761-1766.

[6] Grady WM，Rajput A，Lutterbaugh JD，etal.Detection of aberrantly methylated hMLH1 promoter DNA in the serum of patients with microsatellite unstable colon cancer[J]. Cancer Res，2001，61(3)：900-902.

[7] James G，Heman，Jeremy R，etal.Methylation-specific PCR ： A novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：9821-9826.

[8] Bae SC，Takahashi E，Zhang YW，etal.Cloning,，mapping and expression of PEBP2 alpha C，a third gene encoding the mammalian Runt domain[J]. Gene，1995，159：245-248.

[9] Song BC，Chung YH，Kin JA，etal.Transforming growth factor-betal as a useful serologic marker of small hepatocellular carcinoma[J]. Cancer ，2002，94(1)：175-180.

[10] Ku JL，Kang SB，Shin YK，etal.Promoter hypermethylation downregulates RUNX3 gene expression in colorectal cancer cell lines[J]. Oncogene，2004，23(40)：6736-6742.

[11]張海元，何小兵，夏鵬.胃腸道惡性腫瘤中Runx3基因甲基化研究[J].長江大學學報(自然科學版)醫(yī)學卷，2008，5(3)：9-13.

[12] Tan SH，Ida Hiroshi，Lau QC，etal.Detection of promoter hypermethylation in serum samples of cancer patients by methylation-specific polymerase chain reaction for tumour suppressor genes including RUNX3[J]. Oncology Reports，2007，18：1225-1230.

[編輯] 一 凡

R735.7

A

1673-1409(2009)02-R013-03

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.02.004

2009-05-29

湖北省教育廳中青年項目(Q20091207)

張海元(1974-)，男，湖北鄂州人，講師，碩士，從事腫瘤分子生物學教學與研究工作。