應(yīng)用光學(xué)成像監(jiān)測(cè)腫瘤治療及抗微生物感染的實(shí)時(shí)過(guò)程

熊 濤

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

應(yīng)用光學(xué)成像監(jiān)測(cè)腫瘤治療及抗微生物感染的實(shí)時(shí)過(guò)程

熊 濤

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

目的：探討光學(xué)成像技術(shù)與基因標(biāo)記技術(shù)結(jié)合的非侵入性在體分子熒光成像實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤治療和抗微生物感染的過(guò)程。方法：利用綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)染人涎腺癌細(xì)胞ACC-M，建立GFP標(biāo)記腫瘤皮下腫瘤生長(zhǎng)治療模型，并對(duì)模型進(jìn)行整體熒光成像的初步研究；同時(shí)也進(jìn)行表達(dá)紅色熒光蛋白(DsRed2)細(xì)菌的腹部感染及治療模型的光學(xué)成像。結(jié)果：?jiǎn)慰寺CC-M-GFP細(xì)胞穩(wěn)定高水平表達(dá)GFP。2只成瘤裸鼠右上側(cè)皮下腫瘤隨時(shí)間推移，熒光區(qū)域面積逐漸增加，在瘤內(nèi)注射后熒光區(qū)域面積略變小。注射大腸桿菌12h后感染已有擴(kuò)散發(fā)生，36h時(shí)熒光擴(kuò)散至整個(gè)腹部，在48h后裸鼠死亡；同時(shí)注射卡那霉素者在12h時(shí)僅少許擴(kuò)散，在36h時(shí)熒光沒(méi)有擴(kuò)散并且熒光強(qiáng)度減弱，在 48h后熒光基本上已探測(cè)不到，裸鼠存活。結(jié)論：光學(xué)成像可以從時(shí)間上和空間上反映腫瘤生長(zhǎng)及細(xì)菌消長(zhǎng)的全過(guò)程，因而這兩種模型同在體光學(xué)成像的結(jié)合為研究腫瘤治療藥物和抗生素篩選提供了一種研究平臺(tái)。

綠色熒光蛋白(GFP)；紅色熒光蛋白(DsRed2)；腫瘤；細(xì)菌；光學(xué)成像

熒光基因標(biāo)記技術(shù)和光子學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，使得光學(xué)成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)腫瘤病理生理動(dòng)力學(xué)過(guò)程的在體研究，其中涉及基因表達(dá)，血管生成，細(xì)胞粘附與遷移，組織間隙和淋巴中的物質(zhì)傳輸，代謝微環(huán)境與藥物傳送等[1，2]，特別是自從綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的出現(xiàn)，光學(xué)成像廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域[3]。基于GFP的在體熒光成像可揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞和分子機(jī)制，非侵入性在體評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物療效[4]。早期GFP標(biāo)記腫瘤研究采用終點(diǎn)分析[5，6](end-point assay)方法檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移灶，但該方法不能實(shí)時(shí)記錄腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程。Yang等[7，8]首先利用整體光學(xué)成像系統(tǒng)對(duì)表達(dá)GFP的腫瘤實(shí)時(shí)非侵入熒光成像，記錄了腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程；同時(shí)Zhao等[9]也利用整體光學(xué)成像系統(tǒng)對(duì)基于GFP微生物感染及治療進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。在體光學(xué)成像作為一種非侵入的外部成像技術(shù)，對(duì)于軟組織和骨轉(zhuǎn)移癌檢測(cè)具有非常靈敏和快速的特點(diǎn)[8]。

為了能夠?yàn)槟[瘤治療藥物和抗生素的篩選搭建一個(gè)很好的平臺(tái)，本研究利用GFP轉(zhuǎn)染人涎腺癌細(xì)胞ACC-M，建立了GFP標(biāo)記腫瘤的皮下腫瘤生長(zhǎng)治療模型，并對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行了整體熒光成像初步研究；同時(shí)進(jìn)行了表達(dá)紅色熒光蛋白(Discosoma sp.Red Fluorescent Protein, DsRed)細(xì)菌的腹部感染及治療模型的光學(xué)成像。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑和儀器 人涎腺癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M由武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供，DMEM(Gibco，USA)，新生小牛血清(杭州四季青公司)，pEGFP-C1和pDsRed2(Clontech，USA)，F(xiàn)uGENE 6(Roche, Switzerland)，G418(Promega, USA)。IX70倒置熒光顯微鏡(Olympus，Japan)，致冷電荷耦合器件(Charge Coupled Device，CCD，Princeton Instruments，USA)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c nu/nu裸鼠由湖北省防疫站實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，鼠齡為4～5周，體質(zhì)量15～20g，在本實(shí)驗(yàn)室無(wú)特定病原體(specific-pathogen free，SPF)的裸鼠間飼養(yǎng)。動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞和細(xì)菌培養(yǎng) 用含10%小牛血清、青霉素100mg/ml和鏈霉素100mg/ml的DMEM培養(yǎng)基作為ACC-M細(xì)胞的培養(yǎng)液，于5%CO2飽和濕度，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)；用每升含10g胰化蛋白胨、酵母提取物5g和氯化鈉5g的LB培養(yǎng)基作為細(xì)菌的液體培養(yǎng)，固體LB培養(yǎng)基需要在每升液體LB中加入瓊脂15g，細(xì)菌培養(yǎng)于37℃的恒溫箱中。

1.2.2細(xì)胞與細(xì)菌轉(zhuǎn)染和篩選 采用FuGENE 6脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ACC-M細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48h，用含800μg/ml G418的培養(yǎng)液篩選細(xì)胞2周，獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞株，接著采用96孔板有限稀釋法進(jìn)行單克隆細(xì)胞的篩選，獲得表達(dá)GFP的單克隆細(xì)胞株，選取其中GFP表達(dá)量最高的單克隆細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株，并命名為ACC-M-GFP；采用氯化鈣法將pDsRed2轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，通過(guò)加有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)平板上進(jìn)行篩選，再由熒光顯微鏡得到高表達(dá)的E. coli DH5α單克隆。

1.2.3腫瘤種植 0.25%的胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ACC-M-GFP細(xì)胞，冰冷的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液( PBS)洗滌3次，最后用適量PBS重懸成密度為1×106個(gè)/ml單細(xì)胞懸液。裸鼠麻醉按0.9ml麻醉劑(10%烏拉坦和2%水合氯醛混合液)/ 100g腹腔注射。對(duì)2只裸鼠進(jìn)行皮下注射0.1ml的 ACC-M-GFP細(xì)胞液建立皮下腫瘤生長(zhǎng)模型。

1.2.4細(xì)菌感染及治療[9]離心收集表達(dá)DsRed2的大腸桿菌DH5α后，用冰冷的PBS洗滌3次，最后用適量PBS重懸成密度為1010～1011個(gè)/ml懸液，采用1ml的注射器(武漢恒康有限公司)注入2只裸鼠腹部，其中1只加用卡那霉素治療，每6h在腹腔內(nèi)注入20mg/ml的卡那霉素0.2ml。

1.2.5整體光學(xué)成像 實(shí)驗(yàn)所用整體光學(xué)成像系統(tǒng)為自制[10，11]。此系統(tǒng)由光源(深圳懿鎏電子有限公司，直徑為5mm的大功率發(fā)光二級(jí)管，波長(zhǎng)范圍為468/30nm用于GFP成像、范圍為525/30nm用于DsRed2成像)、激發(fā)濾光片(沈陽(yáng)匯博光學(xué)技術(shù)有限公司EF-B1， 420～490nm帶通用于GFP成像、460～550nm帶通用于DsRed2成像)、發(fā)射濾光片(沈陽(yáng)匯博光學(xué)技術(shù)有限公司BF-B1， 460～490nm帶通用于GFP成像、520nm長(zhǎng)通用于DsRed2成像)和探測(cè)器(Canon數(shù)碼相機(jī)，型號(hào)：PowerShot G5)組成。成像前，裸鼠輕度麻醉,調(diào)整成像系統(tǒng)進(jìn)行整體熒光成像。

2 結(jié) 果

A為ACC-M-GFP細(xì)胞透射圖B為ACC-M-GFP細(xì)胞熒光圖 (標(biāo)尺為50μm) 圖1 穩(wěn)定高表達(dá)GFP的ACC-M-GFP細(xì)胞

2.1穩(wěn)定高表達(dá)GFP的單克隆細(xì)胞株ACC-M-GFP穩(wěn)定高表達(dá)GFP的ACC-M-GFP細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，在IX70倒置熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出很強(qiáng)的綠色熒光，熒光較為均勻地分布于整個(gè)細(xì)胞內(nèi)。單克隆ACC-M-GFP細(xì)胞在G418篩選壓力下，一直穩(wěn)定高水平表達(dá)GFP(見(jiàn)圖1)。

2.2利用整體光學(xué)成像系統(tǒng)在體監(jiān)測(cè)皮下腫瘤生長(zhǎng)及抑制2只裸鼠移植了涎腺癌細(xì)胞，1周后肉眼觀察到100% 成瘤。每隔5～7d，就對(duì)皮下腫瘤進(jìn)行背景成像和整體熒光成像。右上側(cè)皮下腫瘤隨時(shí)間推移，熒光區(qū)域面積逐漸增加，至37d時(shí)腫瘤大小約為2cm×1cm；右下側(cè)皮下腫瘤長(zhǎng)至20d時(shí)，在腫瘤內(nèi)注射0.1ml順鉑(濃度為0.1mg/ml)，熒光區(qū)域面積略變小(見(jiàn)圖2A)。

2.3腹部感染及治療的整體光學(xué)成像

2.3.1腹部感染大腸桿菌的熒光成像 裸鼠腹部皮下注入表達(dá)紅色熒光蛋白的大腸桿菌DH5α，每隔一定時(shí)間對(duì)注射部位進(jìn)行整體熒光成像。大腸桿菌在12h已經(jīng)有擴(kuò)散發(fā)生，在36h時(shí)熒光擴(kuò)散整至個(gè)腹部，在48h后裸鼠死亡(見(jiàn)圖3)。

A為皮下腫瘤隨時(shí)間生長(zhǎng)的熒光圖；B為透射圖(標(biāo)尺為1cm)圖2 皮下腫瘤生長(zhǎng)

2.3.2治療腹部感染大腸桿菌時(shí)的熒光成像 裸鼠腹部皮下注入表達(dá)紅色熒光蛋白的大腸桿菌DH5α，并立即注射20mg/ml的卡那霉素0.2ml，每隔6h腹腔內(nèi)注入同樣劑量的卡那霉素，同時(shí)每隔一定時(shí)間對(duì)腹腔進(jìn)行整體熒光成像[12]。大腸桿菌在12h時(shí)有少許擴(kuò)散，在36h時(shí)熒光沒(méi)有擴(kuò)散并且熒光強(qiáng)度減弱，在48h后熒光基本上已探測(cè)不到，裸鼠存活(見(jiàn)圖4)。

3 討 論

隨著分子生物學(xué)及基因工程的發(fā)展，光學(xué)成像的概念取得了重大的突破[5]，將基因標(biāo)記技術(shù)與光學(xué)成像方法結(jié)合的非侵入性在體分子熒光成像應(yīng)運(yùn)而生。在光學(xué)成像中，選擇不同波長(zhǎng)的光相當(dāng)于引入一個(gè)新的造影劑，從而真正實(shí)現(xiàn)了無(wú)損、多次重復(fù)地實(shí)時(shí)檢測(cè)[11]。其次，光學(xué)成像儀器相對(duì)于MRI、PET等較便宜，容易為患者所接受。

本研究采用GFP和DsRed2兩種熒光蛋白標(biāo)記腫瘤和大腸桿菌，使腫瘤和大腸桿菌自身成為發(fā)光的光源，從而可以同正常組織區(qū)分開(kāi)來(lái)，最后進(jìn)行在體光學(xué)成像。圖2為采用整體成像在體外觀察的腫瘤的生長(zhǎng)以及順鉑抑制腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程。大腸桿菌感染裸鼠腹部皮下及感染后的治療，我們用這種成像方法實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)了大腸桿菌感染及卡那霉素治療的消長(zhǎng)過(guò)程，如圖3和圖4所示。這些實(shí)驗(yàn)反映了在體光學(xué)成像方法能為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展和微生物消長(zhǎng)過(guò)程提供重要的技術(shù)手段。對(duì)于研究腫瘤治療藥物和細(xì)菌抗生素篩選，本實(shí)驗(yàn)的兩種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯⑹且环N很好的平臺(tái)。

不過(guò)這種方法尚存在一些不足，動(dòng)物組織中存在彈性蛋白和膠原蛋白，它們的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)與GFP類似，圖象中存在一定的背景；另外光在組織傳輸中存在吸收和散射，從而造成光學(xué)成像深度有限[12]。如圖2A腫瘤在第13天的時(shí)候，熒光還特別弱，這就是光在傳輸過(guò)程中被吸收和散射的原因。目前研究者正致力于紅色熒光蛋白(DsRed)及遠(yuǎn)紅外熒光蛋白的研究，由于它們的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)遠(yuǎn)大于GFP，因此它們解決了熒光探針的在體光學(xué)成像的一些困難，實(shí)現(xiàn)了自發(fā)熒光少且成像深度深[13，14]，這些特性使DsRed及遠(yuǎn)紅外熒光蛋白逐漸成為在體熒光成像的理想探針。

在今后的研究中，尚需進(jìn)一步改善光學(xué)成像系統(tǒng)和熒光標(biāo)記探針，對(duì)原位移植瘤的自發(fā)轉(zhuǎn)移進(jìn)行高分辨率的、深層次的實(shí)時(shí)非侵入在體熒光成像，為研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理、藥物作用靶點(diǎn)和評(píng)價(jià)藥物作用效果提供重要技術(shù)平臺(tái)。

致謝：感謝華中科技大學(xué)國(guó)家光電實(shí)驗(yàn)室生物醫(yī)學(xué)光子所給予的支持和幫助。

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[編輯] 一 凡

R730.23；Q63

A

1673-1409(2009)02-R005-04

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.02.002

2009-02-27

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2004CB520804)；湖北省教育廳青年資助項(xiàng)目(Q200712005)；長(zhǎng)江大學(xué)博士啟動(dòng)基金(0364)

熊濤(1974-)，男，湖北荊州人，副教授，博士，從事腫瘤在體光學(xué)成像及細(xì)胞凋亡研究。