人脂聯(lián)素基因的克隆及序列比較分析

劉 峰 陳團(tuán)生 鄭金貴

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002； 福建農(nóng)林大學(xué)醫(yī)院，福建 福州 350002)(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

人脂聯(lián)素基因的克隆及序列比較分析

劉 峰 陳團(tuán)生 鄭金貴

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002； 福建農(nóng)林大學(xué)醫(yī)院，福建 福州 350002)(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

目的：克隆人脂聯(lián)素基因，為進(jìn)一步重組蛋白表達(dá)和生物活性等基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法：應(yīng)用RT-PCR法自人大網(wǎng)膜脂肪組織的總RNA中克隆人脂聯(lián)素全長基因，采用T-A克隆法重組到pMD18-T中，通過菌液PCR鑒定陽性克隆后，測序鑒定。并采用聚類分析等對其序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果：克隆人脂聯(lián)素基因全長為735bp，并登錄GenBank(登錄號(hào)：EU420013)；其編碼244個(gè)氨基酸，理論分子量為26 413.64Da，預(yù)測的等電點(diǎn)為5.42。鄰接法聚類分析表明，人脂聯(lián)素與已報(bào)道的其它哺乳動(dòng)物的脂聯(lián)素相似性達(dá)83%～96%。結(jié)論：成功地克隆了人脂聯(lián)素基因全長序列，人脂聯(lián)素與已報(bào)道的其它哺乳動(dòng)物的脂聯(lián)素序列具有很高的同源性。

人脂聯(lián)素；基因克隆；序列分析

近年來的研究表明，糖尿病患者血液中脂聯(lián)素(Adiponectin)水平降低會(huì)導(dǎo)致其對胰島素敏感性的下降[1]。脂聯(lián)素是Scherer等[2]發(fā)現(xiàn)的一種由脂肪組織特異性分泌的約30kDa的脂肪細(xì)胞因子[3]，能有效促進(jìn)脂肪酸氧化和減少糖異生，從而降低血糖和血脂水平[4,5]。對于2型糖尿病及心血管疾病患者，其血漿中的脂聯(lián)素水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常人，且通常伴有胰島素抵抗和高胰島素血癥。而增加脂聯(lián)素水平則能顯著增強(qiáng)胰島素的敏感性，并能抑制肝糖元生成[6-8]。此外，脂聯(lián)素水平的下降也是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素[9]；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在機(jī)體高表達(dá)脂聯(lián)素后可明顯對抗ApoE基因缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的形成[8]。脂聯(lián)素水平的降低還可致血管功能下降以及冠心病發(fā)病危險(xiǎn)性增加[1,9,10]。本研究從人大網(wǎng)膜脂肪組織克隆脂聯(lián)素編碼區(qū)全長基因，并對其進(jìn)行了序列比較分析，為進(jìn)一步的重組蛋白表達(dá)和生物活性等理論研究與臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料取自于某省立醫(yī)院胃腸外科胃潰瘍患者行胃部分切除術(shù)中取出的大網(wǎng)膜脂肪組織，迅速將其裝入mRNA保護(hù)液(大連寶生物公司)，-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2菌種、質(zhì)粒與主要試劑大腸桿菌(E. coli)DH5α由實(shí)驗(yàn)室保存提供；克隆載體pMD18-T、ExTaq酶、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等購自大連寶生物(TaKaRa)公司。

1.3人大網(wǎng)膜脂肪組織總RNA的提取采用Qiagen公司RNAeasy mini kit提取人大網(wǎng)膜脂肪組織的總RNA；各種RNase-free的槍頭、離心管、RNase-free超純水均購置于百泰克生物工程公司。

1.4RT-PCR使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)將1μg的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以Maeda等[11]報(bào)道的人脂聯(lián)素基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出一對特異性引物(劃線部位為增加的BamHI與SacI酶切位點(diǎn))：

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增條件為94℃ 5min，35個(gè)循環(huán)(94℃ 1min，56℃ 5min，72℃ 1min)，72℃ 10min。

1.5克隆載體構(gòu)建RT-PCR產(chǎn)物膠回收操作步驟參照百泰克生物公司多功能DNA純化回收試劑盒的說明進(jìn)行。參照TaKaRa公司pMD18-T Vector試劑盒的說明將目的片段連接到pMD18-T Vector上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選抗Amp菌落，同時(shí)進(jìn)行菌落PCR鑒定和測序，并命名為pMD-ADPN。

1.6克隆產(chǎn)物酶切鑒定重組質(zhì)粒pMD-ADPN的提取參照百泰克生物公司質(zhì)粒小量提取純化試劑盒的說明進(jìn)行。采用Bam HI、Sac I雙酶切pMD-ADPN，對其進(jìn)行鑒定。

1.7脂聯(lián)素氨基酸序列比對、進(jìn)化樹的構(gòu)建使用CLUSTALX 2.0程序?qū)⑷酥?lián)素的氨基酸序列與其它哺乳動(dòng)物脂聯(lián)素的氨基酸進(jìn)行多序列比對(其它哺乳動(dòng)物的脂聯(lián)素氨基酸序列分別來源于GenBank、EMBL和PDB數(shù)據(jù)庫等)。使用Prosite軟件分析其功能基團(tuán)；利用MEGA 4.0程序，采用鄰接法(1 000 replicates; seed = 64 238)聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1RT-PCR結(jié)果應(yīng)用Qiagen公司RNAeasy mini kit提取人大網(wǎng)膜脂肪組織獲得高質(zhì)量的總RNA；采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA后，RT-PCR結(jié)果顯示在750bp左右出現(xiàn)目標(biāo)條帶(見圖1)。

2.2克隆產(chǎn)物酶切鑒定圖譜采用T-A克隆方法將PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接、轉(zhuǎn)化DH5α；提取質(zhì)粒pMD-ADPN；酶切鑒定表明重組質(zhì)粒為目的質(zhì)粒(見圖2)。

2.3測序結(jié)果測序表明，該cDNA全長為735bp，為一個(gè)完整的開放閱讀框ORF(見圖3)；ORF編碼244個(gè)氨基酸殘基，未修飾蛋白的理論分子量為26 413.64Da，預(yù)測的等電點(diǎn)為5.42。我們克隆的人脂聯(lián)素基因的全長cDNA已在GenBank 登錄，登錄號(hào)為EU420013。

圖3人脂聯(lián)素基因全長cDNA及其推導(dǎo)的氨基酸序列

2.4氨基酸序列比較與分析將我們克隆的脂聯(lián)素與已報(bào)道的其它哺乳動(dòng)物的脂聯(lián)素進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明其與兔(Oryctolaguscuniculus，Oc-Acrp30：ABC60052)、狗(Canislupusfamiliaris,Clf-Acrp30: XP_535838)、灰狼(Canislupus,Cl-Acrp30: ACI01768)、家貓(Feliscatus,Fc-Acrp30: NP_001078907)、貍(Nyctereutesprocyonoides,Np-Acrp30: AAX73246)、歐洲棕熊(Ursusarctos,Ua-Acrp30: ACI01763)、北極狐(Vulpeslagopus,Vl-Acrp30: AAX73247)、歐洲臭鼬(Mustelaputorius,Mp-Acrp30: ACI01766)、挪威鼠(Rattusnorvegicus,Rn-Acrp30: NP_653345)、紫貂(Marteszibellina,Mz-Acrp30: ACI01764)、小家鼠(Musmusculus,Mm-Acrp30: AAH28770)、牛(Bostaurus, Bt-Acrp30: AAK58902)、獼猴(Macacamulatta,Mmu-Acrp30: AF404407)、馬(Equuscaballus, Ec-Acrp30: XP_001499564)、水貂(Neovisonvison,Nv-Acrp30: ACI01765)、猿猴(Macacafuscata,Mf-Acrp30: BAG16752)等脂聯(lián)素的序列同源性都很高，達(dá)83%～96%的一致性。結(jié)果如圖4所示(見第77頁彩色圖版)。

一致的序列用點(diǎn)標(biāo)出；橫線表示空缺。人脂聯(lián)素的氨基酸序列下標(biāo)紅線。哺乳動(dòng)物脂聯(lián)素氨基酸序列與人脂聯(lián)素的氨基酸序列的相似性被列在序列比對的末端。GenBank等數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)分別為：兔(Oryctolagus cuniculus, ABC60052)、狗(Canis lupus familiaris, XP_535838、灰狼 (Canis lupus,ACI01768)、家貓(Felis catus, NP_001078907)、貍(Nyctereutes procyonoides, AAX73246)、歐洲棕熊(Ursus arctos, ACI01763)、北極狐(Vulpes lagopus, AAX73247)、歐洲臭鼬(Mustela putorius,ACI01766)、紫貂(Martes zibellina, ACI01764)、小家鼠(Mus musculus, AAH28770)、牛(Bos taurus, AAK58902) 、獼猴(Macaca mulatta, AF404407) 、馬(Equus caballus,XP_001499564)、水貂(Neovison vison, ACI01765)、猿猴(Macaca fuscata,BAG16752)。圖4 使用GLUSTAL X 2.0將人脂聯(lián)素的氨基酸序列與其他哺乳動(dòng)物的脂聯(lián)素氨基酸進(jìn)行比對

圖5 利用MEGA 4.0程序，采用鄰接法(1 000 replicates;seed=64 238)聚類分析構(gòu)建哺乳動(dòng)物17個(gè)種的系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)分析軟件Prosite對人脂聯(lián)素氨基酸序列進(jìn)行分析，人體的脂聯(lián)素由244個(gè)氨基酸組成，包括氨基端信號(hào)肽序列(1-18aa)、膠原樣結(jié)構(gòu)域(19-107aa)和羧基末端的球形結(jié)構(gòu)域等；高度保守的motifs包括GEKGEKGD、GPKGD、GRKGE等，對脂聯(lián)素發(fā)揮活性功能起重要作用，組成了該家族的信號(hào)模式；其中膠原結(jié)構(gòu)域內(nèi)的四個(gè)高度保守的賴氨酸是蛋白糖基化及羥基化的位點(diǎn)。采用鄰接法(neighbour joining，NJ)聚類分析結(jié)果表明，人脂聯(lián)素與大多數(shù)哺乳動(dòng)物的親緣關(guān)系都較近(見圖5)。

3 討 論

人脂聯(lián)素基因位于染色體3q27，該位點(diǎn)是2型糖尿病、代謝綜合癥和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的易感位點(diǎn)。2型糖尿病多在35～40歲之后發(fā)病，目前占我國糖尿病患者90%以上。2型糖尿病病人體內(nèi)并非完全喪失產(chǎn)生胰島素的能力，甚至有的患者體內(nèi)胰島素產(chǎn)生過多，因此應(yīng)用胰島素進(jìn)行治療的效果被大打折扣，即我們常說的“胰島素抵抗”。研究表明胰島素敏感性的下降是由于血中脂聯(lián)素水平降低所致[1]；當(dāng)敲除脂聯(lián)素基因后，高脂飲食可以誘發(fā)出機(jī)體嚴(yán)重的胰島素抵抗[11]。對于脂聯(lián)素基因敲除的小鼠，用壓力負(fù)荷方式極易誘導(dǎo)出心肌肥厚，而將腺病毒帶的脂聯(lián)素基因重新轉(zhuǎn)入體內(nèi)后可以逆轉(zhuǎn)這種趨勢[9]。

脂聯(lián)素對機(jī)體胰島素的增敏可能是通過靶器官肝和肌肉而起作用的[12]。脂聯(lián)素可通過加強(qiáng)胰島素介導(dǎo)的胰島素受體酪氨酸磷酸化，從而激活胰島素受體底物-1(IRS-1)介導(dǎo)的胰島素信號(hào)系統(tǒng)，使肌肉組織中糖攝取增加；通過激活5’AMP激活的蛋白激酶(AMPK)直接刺激葡萄糖利用和脂肪酸氧化，調(diào)節(jié)胰島素敏感性[6, 13]。此外，脂聯(lián)素抑制糖異生途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶基因(葡萄糖-6-磷酸酶及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因)的表達(dá)，從而降低血糖濃度，進(jìn)而改善胰島素抵抗[4, 6]。而脂聯(lián)素水平低下可降低肌肉脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1的mRNA和胰島素受體底物-1(IRS-1)介導(dǎo)的胰島素信號(hào)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的胰島素抵抗[12]。提升脂聯(lián)素水平能增強(qiáng)胰島素的敏感性，并能降低血糖水平，因而在臨床治療上具有潛在的較大的價(jià)值。

本研究從人大網(wǎng)膜脂肪組織中提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，獲得含人脂聯(lián)素基因的重組質(zhì)粒載體pMD-ADPN。測序表明，與Maeda等[11]報(bào)道的人脂聯(lián)素基因序列同源性達(dá)100%；未發(fā)生任何突變等，提示我們成功的克隆獲得了目的基因。RNA的獲取是本實(shí)驗(yàn)研究中一個(gè)基本關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了能夠獲得完整的、豐度較高的mRNA，我們在手術(shù)臺(tái)獲取人大網(wǎng)膜脂肪組織后，迅速將其裝入mRNA保護(hù)液(TaKaRa)，以防止RNA的降解。在提取過程中則嚴(yán)格防止RNase的污染。實(shí)驗(yàn)表明，通過使用Qiagen公司RNAeasy mini kit獲得了高豐度和高質(zhì)量的RNA，為本研究的順利進(jìn)行奠定了重要的基礎(chǔ)。通過成功的克隆人脂聯(lián)素基因，為重組表達(dá)脂聯(lián)素，進(jìn)一步為基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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[編輯] 一 凡

Q781

A

1673-1409(2009)02-R001-04

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.02.001

2009-05-06

福建省重大科技專題項(xiàng)目(2008NZ0001-4)；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009J01058)；福建省科技項(xiàng)目(2008F5010)；福建省科技創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目(2007S1001)

劉峰(1976-), 男, 河南固始人，助理研究員，博士生，從事品質(zhì)生物技術(shù)研究。