阿維菌素類藥物殘留檢測方法的研究進(jìn)展

羅曉琴　張春葉

摘要阿維菌素類藥物作為一種抗寄生蟲藥物,近年來在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。就國內(nèi)外有關(guān)AVMs殘留檢測方法作一綜述,為更加深入、全面地了解動物性食品中AVMs殘留研究奠定基礎(chǔ),同時(shí)為開展AVMs殘留檢測提供參考。

關(guān)鍵詞阿維菌素;藥物殘留;檢測方法

中圖分類號S851.34+7.109文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)15-0334-02

寄生蟲病是家畜常見的、危害嚴(yán)重的疾病之一,阿維菌素類藥物(Avermectins,AVMs)的開發(fā),開辟了寄生蟲藥物的新里程碑,使抗蠕蟲藥物作用劑量由mg/kg級下降到μg/kg級。AVMs對線蟲和體外節(jié)肢動物有較強(qiáng)的驅(qū)殺作用,為農(nóng)作物保護(hù)、動物和人類健康做出了重大貢獻(xiàn) [1-3]。但是,AVMs作為脂溶性藥物,在動物體內(nèi)的殘效時(shí)間較長[4],因此按世界衛(wèi)生組織(WHO)5級分類標(biāo)準(zhǔn),仍將其列為高毒化合物。阿維菌素類藥物有阿維菌素、伊維菌素、埃普利諾菌素、多拉菌素(DOR)、莫西菌素、塞拉菌素和甲胺基阿維菌素等藥物[5,6]。

目前隨著人們對畜禽產(chǎn)品質(zhì)量要求越來越嚴(yán)格,幾乎每個(gè)國家對食品中獸藥殘留都有相關(guān)的限量規(guī)定。因此,動物組織中AVMs殘留成為獸藥殘留研究領(lǐng)域重點(diǎn)監(jiān)控對象之一,殘留檢測方法顯得極其重要。目前,關(guān)于AVMs在動物性食品中的單殘留和多殘留檢測方法,國外報(bào)道相對較多一些,國內(nèi)報(bào)道很少。

1國內(nèi)外檢測方法研究進(jìn)展

1.1薄層色譜法(TLC)

Malanikova等曾使用TLC法檢測阿維菌素,在硅膠薄層板上涂上熒光指示劑,用于樣品檢測。但TLC與高效液相色譜法相比較,靈敏度較低(1 000×10-9),一般只作定性分析,很少用于殘留檢測[7]。

1.2液相色譜-紫外檢測方法(HPLC-UV)

根據(jù)阿維菌素類藥物的共軛二烯結(jié)構(gòu)在λ=240~250nm處有強(qiáng)烈的紫外吸收,建立起液相色譜-紫外檢測方法,一般采用反相液相色譜法[8,9]。由于阿維菌素類藥物在體內(nèi)的最小有效濃度很低,而紫外檢測器對阿維菌素類藥物的最低檢測限為1~2ng/mL[10],很難檢出。而且,紫外檢測器檢測選擇性不高,關(guān)于AVMs的UV測定法并不適合AVMs的殘留分析[11],HPLC-UV法多用于制劑中阿維菌素類藥物的檢測,而很少用于實(shí)際樣品集體殘留檢測。

1.3液相色譜-熒光檢測方法(HPLC-FLD)

與紫外檢測器相比,熒光檢測器更靈敏,高約100倍,對樣品量很少或濃度非常低的痕量分析特別適用。由于許多物質(zhì)不發(fā)射熒光,只有那些具有對稱共軛和非強(qiáng)離子化的化合物才能發(fā)射熒光,因此HPLC-FLD檢測法受基體干擾少。與HPLC-UV比較,此方法大大提高了檢測限,如在血漿中的AVMs檢測限已達(dá)到0.02ng/mL[12]。然而由于AVMs本身沒有對稱共軛結(jié)構(gòu),不能直接用熒光檢測器檢測,而只有經(jīng)熒光衍生化后,生成具有對稱共軛的苯環(huán)結(jié)構(gòu)才能發(fā)射熒光。

1.4液相色譜-質(zhì)譜檢測方法(HPLC-MS)

阿維菌素類藥物殘留檢測的確證方法也得到了發(fā)展:HPLC-MS法檢測靈敏度高,能方便地對痕量獸藥多殘留組分進(jìn)行檢測,同時(shí)能對獸藥殘留組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證,因而極可能成為AVMs多組分殘留確證檢測的最佳方法之一。Howells和Saner以大氣壓化學(xué)電離-質(zhì)譜(APCI/MS)方法測定了AVMs、IVM、EP、DOR 和MOX殘留,定量限分別為3.1ng/g、3.2ng/g、2.2ng/g、4.0ng/g和3.2ng/g[13]。Gia-nell等以電子轟擊離子化-質(zhì)譜(EI/MS)方法檢測了IVM殘留[14]。

1.5液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC3/MS3/MS)

LC3/MS3/MS法在液質(zhì)聯(lián)用法的基礎(chǔ)上再進(jìn)行質(zhì)譜串聯(lián),能同時(shí)檢測更多種藥物,減少了工作量。Sheridan1R等[15]研究報(bào)道了牛奶中5種AVMs驅(qū)蟲劑,即伊維菌素、阿維菌素、依立菌素、莫西菌素和米爾倍霉素的多殘留檢測方法,此方法使用簡單的液液萃取,后用液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS-MS)進(jìn)行定性、定量分離檢測。

1.6在線超臨界流體凈化技術(shù)(SF3/HPLC3/FLD)

用于AVMs的多殘留檢測方法,在線SF3/HPLC3/FLD主要優(yōu)點(diǎn)在于實(shí)現(xiàn)分離分析自動化,能定量地將萃取物轉(zhuǎn)入分析系統(tǒng),靈敏度高,適于痕量組分的分析。Danaher等建立了動物肝臟中阿維菌素、伊維菌素、依立菌素和多拉菌素多殘留的超臨界流體凈化方法。

1.7免疫親和色譜技術(shù)(immunoaffinity chromatography,IAC)

以免疫結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的柱色譜技術(shù),其原理是將抗體與惰性基質(zhì)偶聯(lián)制成免疫吸附劑,裝柱。當(dāng)待測組分流經(jīng)IAC 柱時(shí),抗原與相應(yīng)抗體選擇性結(jié)合,其余雜質(zhì)則流出IAC 柱。再用適宜的洗脫溶劑將抗原洗脫,使樣品得到有效分離、凈化和濃縮。其操作方式有分批法和柱色譜法2種,并且IAC柱再生處理后可重復(fù)使用。MIAC(multi-immunoaffinity)和高效親和色譜(HPIAC)是其發(fā)展方向。

1.8酶聯(lián)免疫法(ELISA)

酶聯(lián)免疫法(ELISA)是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。由于阿維菌素類藥物是半抗原,不能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,需與大分子載體物質(zhì)(如蛋白質(zhì))相結(jié)合制備人工抗原,使其具有免疫源性,免疫動物產(chǎn)生特異性的抗體,然后建立免疫競爭法。此方法簡單、快速,且不需要昂貴的儀器設(shè)備,適合于大批量樣品篩選,便于推廣。ShiW等[16]研究報(bào)道了牛肝組織中阿維菌素、伊維菌素、依立菌素的多殘留檢測間接競爭ELISA。篩選具有對AVMs最高抗體滴度的血清作為間接競爭ELISA反應(yīng),此血清與阿維菌素的交叉反應(yīng)率為100%,與依立菌素的交叉反應(yīng)率為145.4%,與伊維菌素的交叉反應(yīng)率為25%。此方法的定量檢測限為1.06ng/mL。

2前景展望

綜上所述,各種檢測方法均有其優(yōu)勢和相對的不足之處。由于阿維菌素類藥物臨床使用劑量小,分子量大,極難氣化,無法使用氣相色譜(gas chromatography,GC)檢測,而薄層色譜法檢測限高,不夠靈敏,達(dá)不到殘留分析的要求。高效液相色譜法(HPLC)靈敏度高,檢測限能夠低于最高殘留限量(MRL),方法穩(wěn)定、精確度高、特異性強(qiáng),但是存在樣品前處理復(fù)雜、需要專業(yè)的操作人員、花費(fèi)較高等不足之處。液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS-MS)由于結(jié)合了質(zhì)譜技術(shù),檢測靈敏度可以達(dá)到納克、皮克水平,因此常用于確證分析,尤其是在國外應(yīng)用較多,但由于其檢測成本較高,在國內(nèi)推廣應(yīng)用受到限制。

相比之下,酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法不僅避免了HPLC法樣品前處理復(fù)雜和耗時(shí)、單個(gè)樣本檢測成本高等缺點(diǎn),還具有靈敏度較高、特異性強(qiáng)、適用于大量樣品的快速篩選等優(yōu)點(diǎn)。因此,免疫學(xué)檢測方法在基層大規(guī)模篩選檢測中有廣泛的應(yīng)用前景。

3參考文獻(xiàn)

[1] 沈建忠,謝聯(lián)金.獸醫(yī)藥理學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2003.

[2] 李俊鎖,邱月明.獸藥殘留分析[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2002.

[3] 扈洪波,朱蓓蕾,李俊鎖.阿維菌素類藥物的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2000(6):520-529.

[4] MARRINER S E,MCKINNON I,BEGAN L A.The pharmacokinetics of ivermectin after oral and subcutaneous administration to sheep and horses[J].Vet Phar and Ther,1987(10):175-176.

[5] EGERTOU J E.Avermectins,a new family of potent antelmintic agents:efficacy of the Bla compent[J].Antimicrob,Agents Chernother,1979(15):372-378.

[6] TAKAHASHI Y,MATSUMOTO A,SEINO A,et a1.Streptomyces avermectinius sp.nov.an avermectin producing strain[J].Int J Syst Evol Microbiol,2002,52(6):2163-2168.

[7] 陳靜,羅永煌.阿維菌素類藥物在動物性食品中的殘留檢測研究概況[J].貴州畜牧獸醫(yī),2007(4):9-11.

[8] REUVERS T,DIAZ R,DE POZUELO M M,et al.Rapid screening method for ivermectin residue detection in cattle muscle and liver by liquid chromatography with UV detection[J].Anal Chim Acta,1993(275):353-358.

[9] BERNAL J L,DEL NOZAL M J,SALAS M,et al.HPLC determination of residual ivermectin in cattle dung following subcutaneous injection[J].Liq Chromatogr,1994(17):2429-2444.

[10] 李俊鎖,錢傳范.牛組織中阿維菌素殘留的ELISA研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),1997,28(1):77-83.

[11] DEGROODT J M,DE BUKANSKI B W,SREBMIK S,et al.Deter-mination of ivermectin residues in meat and liver by HPLC and fluo-rometric detection[J].Liq.Chromatogr,1994(17):1419-1420.

[12] MONTIGNY P,SHIM J S K,PIVNICHNY J V.Liquid chromatog-raphic determination of ivermectin in animal plasma with trifluoroacetic anhydride and N-methylimidazole as the derivatization reagent[J].J Pharm Biomed Anal,1990(8):507-511.

[13] HOWELLS L,SANER M J. Multi-residue analysis of avermectins and moxidectin by ion-trap LC-MS[J].Analyst,2001(126):155-160.

[14] GIANELL L,MELLERIO G G,SIVIERO E,et al. Mass spectrometry of avermectins:structural determination of two derivatives ivermectin Bla.Rapid commun[J].Mass Spectrom,2000(14):1260-1265.

[15] SHERDAN R,DESJARDINS L. Determination of abamectin,dora-mectin,emamectin,Eprinomectin and moxidectin in milk by liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry[J].J AOAC Int, 2006, 89(4):1088-1094.

[16] SHIW,HE J,JIANG H,et al,Determination of multiresidue of aver-mectin in bovine liver by an indirect competitive EL ISA[J].Agric Food Chem,2006,54(17):6143-6146.