揚(yáng)州地區(qū)雞病原性大腸桿菌的分離與鑒定

吳華俊　任　文　周梅霞　張春云

摘要對揚(yáng)州市大型雞場的大腸桿菌病情況進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷,對病死雞進(jìn)行了病理剖檢,分離出病原菌142株,經(jīng)生化試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定,確診為病原性大腸桿菌的128株。對揚(yáng)州市大腸桿菌病常見血清型的種類、比例、分布有所了解,同時(shí)通過相關(guān)的致病性試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn),為臨床用藥和免疫計(jì)劃提供了可參考的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞雞;大腸桿菌;分離;鑒定;江蘇揚(yáng)州

中圖分類號 S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)15-0306-02

AetiologicalIsolationandIdentificationofE.colifromChickeninYangzhouArea

WU Hua-jun 1REN Wen 2ZHOU Mei-xia 2ZHANG Chun-yun 3 *

(1 Yangzhou Livestock Farm Veterinary Station,Yangzhou Jiangsu 225009; 2 Veterinary Station ofBali Town ,Development Zone of Yangzhou City; 3 Bureau ofAgriculture and Forestry ofYizheng City)

AbstractThe investigation on epidemiology and clinic diagnosis of E.coli were carried out in large chicken houses of Yangzhou in 2006. A total of 142 isolations were obtained from binganatomizing infected and dead chicken, and 128 isolations were identified through biochemical reactions and serotype test. The kinds of E.coli serotypes as well as the percent and distribution in Yanngzhou was investigated, and it might had potential effect onclinical drug-use and immunity plan through pathogenicity test and sensitive experiment.

Key wordschicken;E.coli;isolation;identification; Yangzhou in Jiangsu

雞大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的多種疾病的總稱,是家禽最常見的病原菌之一。主要存在于病雞的腸道及分泌物與其他組織器官中,病雞、雞糞及污染種蛋為主要傳染源。在生產(chǎn)中病雞死雞處理不當(dāng)、種蛋消毒不嚴(yán)格、雞舍及四周環(huán)境消毒不徹底、飼養(yǎng)管理差、飼喂污染的飼料和水等,均可促進(jìn)該病的流行。該病全年均可發(fā)生,但以冬季和夏季多發(fā),常呈地方性流行。雞大腸桿菌病最常見的血清型是O1、O2、O78和O35,生產(chǎn)中使用的疫苗也以這幾種為主。但從國內(nèi)眾多報(bào)道看,我國分離到的禽源性大腸桿菌的血清型眾多,且不同地區(qū)差異較大,這將制約疫苗的免疫效果。

大腸桿菌病主要分為敗血癥、卵黃性腹膜炎、臍炎及全眼球炎等4個(gè)類型,其臨床癥狀及剖檢病變各不相同。為了掌握全市雞大腸桿菌病病原性,筆者特進(jìn)行了病原性大腸桿菌的分離與鑒定,為本病的免疫提供理論依據(jù),同時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn),為臨床用藥提供參考。

1材料與方法

1.1材料

病料來源于揚(yáng)州市各雞場與獸醫(yī)站臨診上有典型大腸桿菌病病變的病、死雞。葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、尿素、硫化氫、蛋白胨等生化發(fā)酵培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂為杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn);血清型鑒定所用營養(yǎng)瓊脂斜面、營養(yǎng)肉湯、LB培養(yǎng)基參照有關(guān)文獻(xiàn)配制。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗O血清購自中國獸藥監(jiān)察所。試驗(yàn)雞為1日齡雛雞240羽,公、母各占1/2,購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所。藥敏紙片購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)。無菌采取上述病、死雞的心血、肝、氣囊等病料劃線于麥康凱斜面,37℃培養(yǎng)18h,挑取典型菌落在麥康凱平板上分區(qū)劃線,37℃培養(yǎng)18h,選取單個(gè)典型菌落純培養(yǎng)后凍干保存。

1.2.2生化試驗(yàn)。按文獻(xiàn)報(bào)道方法對所有分離株進(jìn)行10項(xiàng)生化指標(biāo)的測定。

1.2.3血清型鑒定。所有分離株首先經(jīng)玻板凝集試驗(yàn)初步篩選可能的O血清型,然后通過試管凝集試驗(yàn)確定其O血清型。定型標(biāo)準(zhǔn)為血清的試管凝集價(jià)不小于1∶640。參照文獻(xiàn)進(jìn)行。

1.2.4致病性試驗(yàn)。240羽1日齡雛雞隨機(jī)分為40組,每組6只,公、母各占1/2;按文獻(xiàn)的方法,分別將10個(gè)O78、5個(gè)O2、5個(gè)O127、5個(gè)O18、5個(gè)O1、3個(gè)O4、3個(gè)O24、1個(gè)O88、1個(gè)O11和1個(gè)O26分離株用LB肉湯培養(yǎng)24h,取0.1mL(含約108cfu/mL)進(jìn)行氣管內(nèi)注射,1組注射LB肉湯0.1mL作對照。每天上、下午各記錄1次雞的死亡數(shù)、病變,并以死亡雞心血作細(xì)菌分離、鑒定,直到接種后7d為止,7d后仍存活的雞進(jìn)行撲殺,觀察病變并作細(xì)菌分離鑒定。根據(jù)雞的死亡數(shù)和病變程度確定分離株的致病性:一是高致病株。50%以上的接種雞死亡或產(chǎn)生嚴(yán)重病變(心包炎、肝周炎、氣囊炎、肝壞死等)。二是中度致病株。接種雞不死亡,產(chǎn)生嚴(yán)重病變者不超過50%。三是低致病性分離株。接種雞不死亡,僅在氣囊上偶而產(chǎn)生病變。

1.2.5藥敏試驗(yàn)。選取不同地區(qū)分離株10株,在無菌條件下將24h肉湯培養(yǎng)菌物,用滅菌生理鹽水作10倍稀釋,取0.2mL滴加在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上,用滅菌L棒涂勻,然后貼上紙片,每個(gè)平板貼5種紙片,置37℃溫箱中培養(yǎng)18h,用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)直徑。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌分離

213只病死雞,共分離出142株細(xì)菌,經(jīng)生化鑒定,其中128個(gè)分離株屬大腸桿菌。

2.2生化試驗(yàn)結(jié)果

128個(gè)分離株的10項(xiàng)生化試驗(yàn)結(jié)果符合大腸桿菌的特征。

2.3血清型鑒定結(jié)果

142個(gè)分離株中,除12株未能定型、2株自凝外,測定出128個(gè)分離株的血清型。血清型的分布及所占比例見表1。

2.4致病性試驗(yàn)結(jié)果

接種雛雞主要表現(xiàn)精神沉郁,呼吸困難,翅膀下垂,縮頸,頸羽豎立,食欲下降或廢絕,高致病性分離株引起接種雛雞死亡高峰在12~24h;此間病死雞病變主要為心包積液,氣囊混濁和肝臟腫大、淤血。典型病變出現(xiàn)于接種后48h死亡雞,可見纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊上可見多量干酪樣滲出物。病程越長,病變越典型。接種后7d內(nèi)死亡雞數(shù):高致病株多在5～6只;中度致病株多在1～2只;低致病株則不見死亡,只見個(gè)別雞氣囊上有少量干酪樣分泌物。對照雞均健活,7日齡撲殺時(shí)未見任何病變,心、肝等處也未分離出任何細(xì)菌。從接種后死亡雞或產(chǎn)生嚴(yán)重病變雞體內(nèi)均能分離到接種菌,所測39個(gè)分離株的致病性見表2。

2.5藥敏試驗(yàn)結(jié)果

用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)直徑。抑菌環(huán)直徑在15mm以上者為高敏;10～15mm為中敏;10mm以下為低敏;無抑菌環(huán)為耐藥。從試驗(yàn)結(jié)果看,不同場、不同地區(qū)、不同菌株的對各種藥物的敏感程度不盡相同,存在一定的差異性,但也存在某些共同點(diǎn),即生產(chǎn)中很少用或從沒用過的藥敏感程度高,如林霉素鈉、先鋒類、阿米卡星等均為高敏感,生產(chǎn)中經(jīng)常用的藥敏感程度低或耐藥,如青霉素類、氯霉素、磺胺類、諾氟沙星等均為低敏或耐藥。

3結(jié)論與討論

(1)在揚(yáng)州市142個(gè)禽源性大腸桿菌分離株中,共測出128個(gè)分離株的血清型,其種類(血清型)達(dá)10個(gè),但以O(shè)78、O2、O127、O18、O1為主,共109株,占定型菌株的85.16%;其中O78有40個(gè)分離株,占定型菌株的31.25%。因此,在本次調(diào)查中,O78、O2、O127、O18、O1等5個(gè)血清型為優(yōu)勢血清型。

(2)國外報(bào)道,禽致病性大腸桿菌常見血清型為O1、O2、O35和O78。本次調(diào)查所得5個(gè)優(yōu)勢血清型中,有2個(gè)不在此列,其中O127所占比例為13.28%,O18所占比例為10.94%,這2個(gè)血清型不僅不屬國外常見的致病性血清型,國內(nèi)也較少報(bào)道。因此,對非常見血清型分離株進(jìn)行深入研究,將有助于了解我國禽大腸桿菌病的致病機(jī)理、免疫保護(hù)機(jī)理與防制措施。

(3)在128個(gè)定型菌株中,約60%的菌株在玻板上與2種或2種以上的標(biāo)準(zhǔn)血清反應(yīng),只有通過試管凝集試驗(yàn)才能確定其所屬血清型;也有為數(shù)不少的菌株盡管在玻板上只與某一種標(biāo)準(zhǔn)血清反應(yīng),但作試管凝集時(shí),凝集價(jià)又不夠定型標(biāo)準(zhǔn)而判為未定型菌株。

(4)調(diào)查結(jié)果與國外、國內(nèi)報(bào)道相比,揚(yáng)州市禽大腸桿菌分離株存在多樣性,但同時(shí)存在著優(yōu)勢血清型。

(5)生化試驗(yàn)結(jié)果表明,完全符合大腸桿菌生化特性的分離株占多數(shù),極少數(shù)菌株在個(gè)別檢測項(xiàng)上不符。因此,在作大腸桿菌的生化鑒定時(shí),應(yīng)多設(shè)一些有針對性的檢驗(yàn)項(xiàng),以便在個(gè)別檢測項(xiàng)不符時(shí),不致誤判。

(6)所測39個(gè)分離株對1日齡雛雞均有致病性。5個(gè)優(yōu)勢血清型分離株中,高度致病者占86.67%,中度致病者占10%,低致病者占3.33%,由此表明,所分離到的優(yōu)勢血清型分離株均有致病性。

(7)致病性試驗(yàn)結(jié)果表明,1日齡雛雞需來自衛(wèi)生防疫制度健全、雞群狀況良好的種雞場,因?yàn)樵谠囼?yàn)期間不得使用任何抗生素類藥物,健康對照雞不得發(fā)病,且不能從其臟器分離到任何細(xì)菌。因此,有條件時(shí),應(yīng)采用SPF雞。

(8)大腸桿菌分離株的致病性存在明顯差異。絕大多數(shù)高致病株總能引起接種雞高死亡率(致死比例常為5/6～6/6);中度致病株可引起較低死亡率(致死比例常為1/6～2/6);而低致病株則不引起死亡。因而,結(jié)合死亡雞及撲殺雞的病變程度,很容易判斷其致病性的高低。

(9)致病性試驗(yàn)中,不同地區(qū)、不同血清型的受試分離株的致病性無明顯差異。表明分離株的致病性不受地區(qū)、血清型的影響,與國外強(qiáng)調(diào)的致病性血清型多屬O1、O2、O78,很少分離到其他血清型的結(jié)論并不完全一致。這只能說明,我國的禽大腸桿菌病比國外更復(fù)雜。多致病血清型的存在,給防制工作增加了難度;優(yōu)勢血清型的出現(xiàn),又為最大限度地控制該病提供了條件。

(10)本試驗(yàn)進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,大腸桿菌病原菌的耐藥菌株較多,耐譜較廣,給臨床治療帶來困難。在生產(chǎn)中最好能根據(jù)本場藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用藥物進(jìn)行治療,如無條件做藥敏試驗(yàn),應(yīng)盡可能選用以前不經(jīng)常用或從未用過的藥物進(jìn)行治療。

(11)為了控制本病的發(fā)生,應(yīng)注意環(huán)境衛(wèi)生及消毒,經(jīng)常帶雞消毒,防止飼料及水源的污染,減少應(yīng)激。支原體、新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病的發(fā)生常能引發(fā)大腸桿菌病發(fā)生,所以應(yīng)根據(jù)本地疫情特點(diǎn)制定切實(shí)可行的免疫程序,做好免疫接種工作,提高機(jī)體免疫力。

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