蝴蝶蘭組織培養(yǎng)研究進展

張東旭　張　潔　張學兵　董國興

摘要通過不同培養(yǎng)基、不同激素及添加物對蝴蝶蘭各培養(yǎng)再生途徑的影響進行了概述,為蝴蝶蘭的組培技術研究提供參考。

關鍵詞蝴蝶蘭;組織培養(yǎng);研究進展

中圖分類號 Q943.1;S682.31 文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)15-0191-03

蝴蝶蘭(Phalaenopsis)屬熱帶或亞熱帶的蘭科植物,深受人們的喜愛,研究和開發(fā)蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)具有重要的意義[1]。組織培養(yǎng)是蝴蝶蘭快速繁殖的有效方式,目前主要有3條途徑:一是利用蝴蝶蘭雜交種子在無菌條件下誘導發(fā)芽,獲得再生植株[2];二是從離體器官誘導產生原球莖(Protocorm like-body,以下簡稱PLB),通過原球莖的增殖、分化獲得再生植株,即原球莖再生途徑[3,4];三是通過離體器官誘導產生叢生芽,通過培養(yǎng)叢生芽獲得再生植株,即器官再生途徑[4-7]。

1無菌播種再生途徑

蝴蝶蘭經人工授粉可獲得種子,但種子個體極其微小,結構簡單,沒有胚乳,只有1層極薄的種皮,通常在自然狀態(tài)下很難萌發(fā),需經組織培養(yǎng)無菌播種才能獲得植株。在蝴蝶蘭開花時選擇優(yōu)良植株進行自交或雜交授粉,生長4～6個月后尚未開裂的蒴果可用于試管無菌播種。由于蒴果內種子數量達幾千萬之多,1個蒴果便可繁殖出成千上萬的植株[8]。通過無菌播種人工培養(yǎng),能夠在短期內獲得大量幼小植株,是現階段經濟有效的快速繁殖方法,也是工廠化育苗的重要途徑。種子無菌播種10d后胚明顯膨大,呈鵝黃色,陸續(xù)變成綠色,約1個月的時間形成原球莖)。隨后,原球體拉長,同時原球體上伴隨著長出白色根毛狀物,接著在頂端生長點處長出芽鞘,芽鞘不斷長大,形成第1片鞘葉。至2個月時,于第1片鞘葉對面長出第2片鞘葉,隨著鞘葉的生長,2～3個月的時間在2片鞘葉之間長出真葉。最后,轉移到新的培養(yǎng)基上形成再生植株[8-10]。

魏翠華等[9]研究發(fā)現,添加香蕉汁對蝴蝶蘭種子發(fā)芽、原球體形成以及葉片的生長具有促進作用,水解乳蛋白對種子萌發(fā)有抑制作用,比較光照和黑暗2種培養(yǎng)條件,種子萌發(fā)無明顯差異。章玉平等[10]研究表明,外源植物生長調節(jié)劑對種子萌發(fā)有抑制作用,天然物質如蘋果汁、香蕉汁、胰蛋白胨和活性炭對種子萌發(fā)具有促進作用。不同雜交組合的親本基因型親和力不同,對種子播種的發(fā)芽率和生長發(fā)育狀況有很大影響[9]。魏翠華等[9]認為在培養(yǎng)過程中種子發(fā)芽的速度與接種到培養(yǎng)瓶中的微滴濃度有關,濃度高的,所含種子量多,水量少,發(fā)芽就快些,顯示出發(fā)芽的“群體效應”。

在種子培養(yǎng)過程中用的培養(yǎng)基主要有KC[10]、1/2MS[10]、MS[11]、Kyoto[11]和VW[12]培養(yǎng)基等。張曉申等[13]研究表明,改良的KC培養(yǎng)基中種子發(fā)芽率高達91.2%,周俊輝等[14]認為改良KC培養(yǎng)基處理蝴蝶蘭種子后生長出原球莖的增殖速度最快、長勢最強。通過雜交種子無菌培養(yǎng)能在短時間內獲得大量的再生植株,但由于蝴蝶蘭種子苗是一種雜交品系,因此后代變異率高,除了少數自花系列較穩(wěn)定以外,難以形成品質均一的大規(guī)模栽培品種。

2原球莖(PLB)再生途徑

1974年,Intuwong等利用蝴蝶蘭莖尖誘導出原球莖(PLB),再由原球莖(PLB)分化成幼苗,最后形成完整的再生植株,從而成為蝴蝶蘭種苗生產最有效的方式之一[15]。

大量的研究結果表明,誘導蝴蝶蘭原球莖采用的外植體主要有莖尖[3]、根段[16]、花梗苗根尖[17]、花梗腋芽[18]、葉片[19-22]、胚[23]、花葶節(jié)間[24]、花梗節(jié)或花梗節(jié)間切段[25]和種子[26-28]等。大量的研究報道表明,不同外植體的誘導率存在差異,陳勇等[3]、楊美純等[22]認為莖尖為外植體誘導原球莖狀體發(fā)生則誘導率較高,而潘學峰等[29]、黃象男等[30]認為蝴蝶蘭作為單莖性氣生蘭,用莖尖作為外植體有可能喪失母株,不適宜用來做誘導PLB,秦凡等[31]以莖尖、葉片為外植體進行了研究,莖尖的誘導率為70%,葉片的誘導率為37.8%。同時還發(fā)現誘導原球莖的葉片與切取的部位以及在培養(yǎng)基上放置的方式有關,其中,葉基部誘導率明顯高于葉片中部和葉尖部位,正放在培養(yǎng)基上的葉片原球莖的誘導率明顯高于反放和斜放在培養(yǎng)基上的葉片,反放和斜放在培養(yǎng)基上的葉片幾乎不能誘導原球莖。張元國等[18]以無菌植株的莖尖、葉片、根為外植體進行研究表明,莖尖誘導率較高,只要選擇好培養(yǎng)基且切割得當,誘導率可達100%,而葉和根誘導率太低。陳勇等[3]取無菌苗的幼葉、莖尖、根尖和花梗等為外植體,以莖尖誘導效果最佳,根尖的原球莖誘導效果最差。潘學峰等[29]認為以葉片為外植體則誘導率較低,一般不高于20%,這與秦凡等、張元國等、陳勇等報道的結果是相似的。但彭立新等[19]以花梗腋芽、花梗、幼葉片為外植體進行研究,結果表明幼葉片原球莖體誘導率最高為23%,其他2種外植體誘導率均為零。因此,培養(yǎng)條件、蝴蝶蘭品種不同,結果也不盡相同。

蝴蝶蘭PLB誘導所采用的基本培養(yǎng)基一般包括MS、1/2MS、VW、B5、KC、花寶及其改良型等,陳勇等[3]、姚麗娟等[21]、魯雪華等[25]、王靜等[32]研究結果均認為1/2MS適合PLB增殖,即蝴蝶蘭的原球莖增殖培養(yǎng)以較低的無機鹽濃度為好。但胡海英等[33]用MS和KC培養(yǎng)基,曾宋君等用G3培養(yǎng)基,李進進等[16]用B5培養(yǎng)基也有取得較好的誘導效果。因此,最適培養(yǎng)基的選擇也不盡相同。

激素常采用6-BA,或6-BA和NAA配合使用。楊美純等[26]、秦凡等[31]研究均表明,6-BA是決定原球莖狀體發(fā)生的主要因子。秦凡等[31]在以葉片為外植體進行研究時發(fā)現,6-BA濃度為3.0mg/L時產生原球莖數目較少,但是,原球莖顆粒大,呈綠色;6-BA濃度增到15.0mg/L時產生原球莖數不斷減少,且長勢弱,顏色偏黃,極易玻璃化,最后褐化死亡,而2,4-D對蝴蝶蘭的體細胞胚胎發(fā)生有抑制作用。黃象男等[30]利于正交試驗分析結果表明,6-BA因素的極差(R)最大,培養(yǎng)基因素次之,NAA和AC因素最小,這和楊美純等[22]、秦凡等[31]研究的結果是一致的。

周俊輝等[14]、王靜等[32]、葉曉青等[34]、王芳等[35]均認為適宜濃度的6-BA配合低濃度的NAA更利于PLB增殖。黃象男等[30]認為6-BA濃度對原球莖的增殖速度有顯著地影響,較高的細胞分裂素/生長素比值有利于增殖,而較低的細胞分裂素/生長素比值則有利于生根。但因蝴蝶蘭品種及選用的外植體不同,所以最佳激素濃度也不盡相同。

蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)過程中易褐化[36],褐變的主要原因是材料傷口分泌出酚類化合物,在多酚氧化酶的作用下轉變成醌類物質引起的[37],研究表明活性炭[30,31,35]、椰子汁[31],檸檬酸、VC[29]等物質能起到一定的緩解褐化作用。同時,pH值對褐化也有重要影響,王冬云等[38]研究表明,當培養(yǎng)基pH值為4.5~5.0時,培養(yǎng)物排出的褐變物質較多,pH值為5.4~5.5時排出的褐變物質較少。

組織培養(yǎng)中常用的有機添加物如椰子汁、香蕉和馬鈴薯等是一類含有氨基酸、礦物質、維生素、激素和酶等有機物且成分較為復雜的天然復合物[39]。多數研究證明,它們對細胞和組織的增殖和分化有明顯的促進作用,許多研究人員在天然有機添加物的選擇與應用方面做了大量的工作[40-42]。何松林等[39]研究發(fā)現上述有機添加物對PLB分化、幼苗等有良好的促進作用,在3種添加物中,椰子汁和馬鈴薯優(yōu)于香蕉,而添加椰子汁的培養(yǎng)基對PLB分化幼苗的影響與馬鈴薯的差異較小,馬鈴薯將可能是低成本的有效添加物。研究中發(fā)現添加香蕉的培養(yǎng)基能顯著提高幼苗的干質量,但不利試管苗葉的生長和根的分化。秦凡等[31]試驗結果也表明椰子汁、馬鈴薯對增殖有促進作用。陳勇等[3]用椰子汁、蘋果汁、馬鈴薯汁、香蕉汁及荸薺汁進行研究,得到了與何松林等[39]相似的結論。

除上述各因素對PLB的誘導和增殖有影響外,張元國等[18]在試驗中還發(fā)現,切割或針刺對原球莖狀體誘導和增殖作用效果非常好,外植體切割能明顯地提高原球莖狀體誘導率,增殖時切割或針刺有利于增殖而控制分化,否則原球莖很容易分化和生根。同時還發(fā)現原球莖狀體增殖時有群體優(yōu)勢效應,剛誘導出的原球莖狀體不能過早切割轉移,增殖時切塊應大于等于3mm,過小易褐化,導致PLB死亡。

3芽繁再生途徑

無菌播種再生途徑和原球莖途徑具有在較短的時間內獲得大量的再生植株的優(yōu)點,在蝴蝶蘭繁殖途徑已取得較快的發(fā)展及較為廣泛的應用。但無菌播種再生途徑由于蝴蝶蘭種子苗為雜交品系,后代變異率高,因此除了少數自花系列較穩(wěn)定以外,難以形成品質均一的大規(guī)模栽培品種。PLB途徑經過脫分化階段同樣也存在較高的變異率。遺傳的穩(wěn)定性問題一直以來都是直接影響組培苗工廠化生產的原因之一[1]。為了進一步減少變異,研究者們進行了大量的研究,王懷宇等[6]和劉榮維等[7]人提出了利用器官再生途徑來實現蝴蝶蘭的快速繁殖,并取了成功。該途徑的優(yōu)點是它是一個芽到叢芽的增殖過程,整個過程均未通過脫分化過程形成愈傷組織,保持了母株的特性,對減少品種變異是極其有利的。蝴蝶蘭器官再生途徑材料通常是取花梗下端的休眠芽作為外植體,通過激素、培養(yǎng)條件等因素的控制,誘導叢生芽,最終獲得大量的再生植株[29,38,43]。其優(yōu)點是不損傷母株[6,13],切取花梗后,不僅不影響母株的正常生長與花芽分化,而且還能從整體上進一步了解新品種的特征特性,特別是對新引進的新品種,可以待其開花和確定其觀賞價值后再進行大量繁殖,以避免不必要的浪費。

花?；康男菝哐繛榛ㄑ?在培養(yǎng)過程中可能有2種發(fā)育方向:一是形成花芽;二是形成營養(yǎng)芽。其不同的發(fā)育方向主要受溫度和不同激素等因素的影響,如果培養(yǎng)的溫度低(低于20℃),則容易向花芽方向分化,發(fā)育成花葶(以帶腋芽的花梗節(jié)段為材料誘導花葶,可獲得較多的不定芽誘導起始材料[44]);在高溫條件(高于28℃)下培養(yǎng)易形成營養(yǎng)芽[29,45-47]。王冬云等[38]利用黃花蝴蝶蘭的花梗腋芽為外植體,進行誘導,增殖倍數最高可達12倍,代容春等[48]以蝴蝶蘭無菌幼苗(株高約1.5cm)為外植體,用MS、1/2MS、White、B5培養(yǎng)基進行培養(yǎng),結果表明,以1/2MS促進分株最為明顯。在細胞分裂素與生長素的配比中,6-BA與NAA、IBA或IAA配比均能誘導分株增殖,尤以6-BA與NAA配比分株效果為佳。對6-BA與NAA的配比進行研究發(fā)現,6-BA濃度過高、過低均不利于分株增殖;NAA 則要求較低的濃度。

潘學峰等[29]以蝴蝶蘭的滿天紅品種為材料,取已開花的花梗,選其下端休眠芽作為外植體進行叢生芽誘導,結果表明,隨著6-BA濃度的不斷增加,新增的芽數也隨之不斷增多,增殖的倍數不斷提高。但單獨使用生長素不能使外植體誘導出叢生芽,只有在生長素和細胞分裂素同時存在時,才能誘導出叢生芽,其中以6-BA 12.5mg/L+NAA 0.05mg/L的處理組合效果最佳,增殖倍數可達3.00倍,所誘導出的叢生芽不僅生長健壯,而且顏色鮮嫩,有利于進一步增殖與培育壯苗。而當6-BA濃度高于15.0mg/L時,雖然誘導的叢生芽倍數不斷增加,但所長出的叢生芽生長瘦弱,甚至有些還有畸形現象,不利于進一步增殖與培育壯苗。同時,在增殖階段發(fā)現采用接雙芽比接單芽的增殖效果好,發(fā)生側芽的速度快且整齊健壯,可能是蝴蝶蘭叢芽的發(fā)生也具有群體效應。

林宗鏗等[47]研究表明,叢生芽的增殖率隨6-BA濃度的增加而增加;同時,誘導芽的個體也隨濃度的增加而變的細小。有關去莖尖對芽繁的影響試驗結果表明,去掉莖尖的芽增殖率要明顯的高于對照,這可能是由于去掉頂端優(yōu)勢,有利于誘導叢生芽。在添加附加物方面,代容春等[48]研究表明,椰子汁使增殖系數達 6.1,植株生長良好,根多,植株旺盛,而水解乳蛋白、水解酪蛋白及酵母汁均不能促進分株增殖,反而有輕微抑制的作用。

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