楓香速生優(yōu)良無性系組織培養(yǎng)技術(shù)體系

李 勇

（福建省洋口國有林場，福建順昌 353211）

中國楓香（Liquidambar formosana）生長快，材性好，適應(yīng)性強(qiáng)，是我國南方林區(qū)的主要造林樹種之一，廣泛分布于南方各?。▍^(qū)）濕潤肥沃的立地[1-3]。中國楓香在遺傳改良方面已開展了大量工作，已選育出一大批優(yōu)良品種，如何將優(yōu)良品種快速繁育推廣使用是目前的一個(gè)亟待解決的問題[4-10]。苗木的繁育方式主要是有性和無性兩種，而楓香需達(dá)到一定樹齡才能大量結(jié)實(shí)，僅通過種子繁育實(shí)生苗，在時(shí)間和數(shù)量上難以滿足市場需要[11-12]。在無性繁育方面，楓香扦插繁育十分困難[9]，因此，組培成為楓香快速繁育的一種重要途徑，開展中國楓香速生優(yōu)質(zhì)新品種組培快繁技術(shù)研究，有利于快速培育優(yōu)質(zhì)新品種。本次試驗(yàn)以福建南平試驗(yàn)點(diǎn)早期選擇的優(yōu)良家系中的優(yōu)良單株為材料，通過伐樁促萌無性系化，剪切半木質(zhì)化嫩枝為外植體材料來源，研究楓香優(yōu)良單株組培快繁技術(shù)的誘導(dǎo)、繼代增殖、生根、移栽的最合適培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，為楓香新品種組培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以福建南平試驗(yàn)點(diǎn)早期選擇的楓香為試驗(yàn)材料，采取樹高、胸徑和材積隨機(jī)區(qū)組重復(fù)測量的選優(yōu)方案，從中優(yōu)選出9株表型良好、生長量大的優(yōu)良單株（LFFY-1、LFFY-2、LFFY-3、LFFY-4、LFFY-5、LFFY-6、LFFY-7、 LFFY-8、LFFY-9），其中6年生時(shí)樹高、胸徑和材積的平均值分別可達(dá)6.24 m、7.72 cm、0.015 653 m3，平均遺傳增益分別為4.47%、4.62%和4.90%。本次試驗(yàn)以楓香LFFY-1、LFFY-2、LFFY-3優(yōu)良無性系品種的基部萌條作為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌體系建立

先用10%次氯酸鈉溶液對莖段消毒50 s，再分別采用70%酒精、0.1升汞進(jìn)行后續(xù)消毒處理。本次試驗(yàn)分別設(shè)立的4種不同消毒處理：0.1%升汞12 min；70%酒精10 s+0.1%升汞8 min；70%酒精20 s+0.1%升汞4 min；70%酒精30 s。消毒后，將莖段斜插于無激素MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。每瓶接種1個(gè)莖段，每處理50瓶，重復(fù)5次，每隔2 d對污染瓶進(jìn)行1次剔除，每隔5 d觀察并記錄1次外植體污染和萌發(fā)情況，40 d后統(tǒng)計(jì)萌芽率。

1.2.2 增殖培養(yǎng)

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，按照正交試驗(yàn)L9（34）的設(shè)計(jì)要求設(shè)置試驗(yàn)。試驗(yàn)因素及水平如下：6-BA 0.3～0.9 mg/L， KT 0～1.0 mg/L， IAA 0～1.0 mg/L，附加3.0%蔗糖，pH 5.8。每瓶接種芽苗5個(gè)，每處理接種20瓶，重復(fù)5次，繼代周期30 d，連續(xù)繼代增殖培養(yǎng)3次后，觀察芽苗生長情況，統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng)

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，L9（34）正交試驗(yàn)的試驗(yàn)因素及水平：莖段長度≤0.5 cm、0.6～1.0 cm、1.1～1.4 cm、 ≥1.5 cm；ABT 10.1 、0.3、0.5、 0.8 mg/L； IBA 0.0、 0.5、 1.0、 1.5 mg/L；NAA 0.0、0.2、0.4、0.6 mg/L。附加3.0%蔗糖，pH 5.8。每種處理重復(fù)5次，每個(gè)試驗(yàn)組接種30瓶，每瓶10株，生根周期40 d，每10 d觀察1次，記錄芽苗生長情況，統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.4 移栽馴化與后期管理

生根瓶苗經(jīng)過煉苗后，將瓶苗取出，用清水洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至用0.1%高錳酸鉀溶液滅菌的基質(zhì)中。本試驗(yàn)以紅心土、泥炭土、河砂為組培苗移栽基質(zhì)，共設(shè)置4種處理（表5），每次處理移栽300株，重復(fù)5次。移栽后噴淋定根水，覆蓋薄膜和遮光度為75%的遮陽網(wǎng)，苗期進(jìn)行日常管理。移栽30 d后，觀察幼苗生長情況并統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

組培苗移栽后，在覆蓋薄膜的條件下封閉培養(yǎng)10 d，棚內(nèi)溫度控制在25～30℃，濕度85%左右。在太陽光強(qiáng)烈的情況下須加蓋遮陽網(wǎng)。封閉培養(yǎng)10 d后，掀開薄膜，每天噴水2～3次，保持基質(zhì)濕潤，相對濕度在80%以上。掀開薄膜的同時(shí)，采用1 000倍多菌靈或托布津溶液對幼苗及苗床進(jìn)行滅菌，此后每周用800倍百菌清與1 000倍多菌靈交替噴淋滅菌。移植15 d后進(jìn)行根外施肥，常用肥料包括0.1%高樂、0.1%葉面營養(yǎng)液等。移栽30 d后每隔10 d淋施水肥1次，通常選用尿素（0.1%）或復(fù)合肥（0.1%～0.5%），施肥后用清水洗凈葉片殘留的肥分。

1.2.5 培養(yǎng)條件

組培苗無菌體系建立、分化和生根培養(yǎng)均在培養(yǎng)室中進(jìn)行，培養(yǎng)室溫度為25～27℃，光照強(qiáng)度為2 500 lx，光照時(shí)間為13 h/d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0分析。萌動率、增殖倍數(shù)、生根率和成活率的計(jì)算公式如下：

萌動率（%）=（無感染且有芽點(diǎn)的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100

增殖倍數(shù)=（新增萌芽數(shù)/原先接種的繼代芽苗總數(shù)）×100%

生根率（%）=（萌發(fā)根系的芽數(shù)/接種芽總數(shù)）×100

成活率（%）=（移栽成活的小苗數(shù)/移栽小苗總數(shù)）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌體系的建立

萌動率在不同滅菌處理間有顯著差異（P＜0.05）。70%酒精20 s+0.1%升汞4 min的處理萌動率最高（40.5%）；其次是70%酒精10 s+0.1%升汞8 min（31.2%）。僅用0.1%升汞或70%酒精消毒處理下的萌動率稍低，分別為19.7%、23.4%（表1）。

2.2 增殖培養(yǎng)

楓香組培增殖倍數(shù)在不同激素種類及濃度組合處理間差異顯著（表2）。處理7的增殖倍數(shù)最高（1/2 MS+6-BA 0.9 mg/L+IAA 0.5 mg/L），增殖倍數(shù)為5.3，有效芽數(shù)為4.4個(gè)；處理9次之（1/2 MS+6-BA 0.9 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L），增殖倍數(shù)為5.0，有效芽數(shù)僅2.1個(gè)；處理1的增殖倍數(shù)和有效芽數(shù)均最小，分別為1.9、1.0。對照組CK的增殖倍數(shù)為4.7，有效芽數(shù)為3.6個(gè)。只有當(dāng)所添加的激素達(dá)到了某一適宜濃度和配比才能顯著提高增殖倍數(shù)。

表1 不同滅菌方式對萌動率的影響Tab.1 Effects of different sterilization methods on germination rates

6-BA使用濃度以第3水平（K3=14.9）最佳，KT使用濃度以第1水平（K1=11.5）最佳，IAA使用濃度以第2水平（K2=12.0）最佳，3個(gè)因素作用依次為6-BA＞IAA＞KT（表3）。

表2 不同激素種類及組合對增殖的影響Tab.2 Effects of different hormones and combinations on proliferation

表3 激素處理極差分析結(jié)果Tab.3 The range analysis results of hormone treatment

2.3 生根誘導(dǎo)培養(yǎng)

生根率在不同生長素種類及濃度組合間存在顯著性差異（P＜0.05）。處理10（ABT 10.3 mg/L+IBA 1.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L）的培養(yǎng)基生根率和生根數(shù)明顯高于其他8種處理，生根率和生根數(shù)分別為95.8%和6.1條（表4）。9～16號處理組采用長度大于1.1 cm的繼代小芽作為生根材料，生根率均達(dá)到70%以上；而采用長度小于1.1 cm的繼代小芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，僅有7號處理組的生根率達(dá)70%以上，有4個(gè)處理組的生根率在60%以下，說明培養(yǎng)材料的選擇對楓香的生根誘導(dǎo)影響較大。

表4 不同生長素組合對生根誘導(dǎo)的影響Tab.4 Effects of different auxin combinations on root induction

芽長以第3水平（K3=337.90）最佳，ABT和IBA使用濃度均以第4水平（K4=291.4和K4=329.4）最佳，NAA使用濃度以第3水平（K3=286.4）最佳（表5）。由R值可知，4個(gè)因素的作用依次為芽長＞IBA＞ABT＞NAA。

2.4 生根苗移栽

以紅心土+泥炭土（1∶1）配比的基質(zhì)最好，移栽成活率達(dá)93%；紅心土移栽成活率最低（80%）；紅心土與河沙混合的2種處理，移栽成活率分別為85%和86%（表6）。采用紅心土移栽成活率較低，可能的原因是紅心土過于黏重造成土壤通氣透水條件差，在紅心土中加入適量泥炭土或河沙，利于改善土壤的通氣透水性。

表6 不同基質(zhì)對生根苗移栽成活率的影響Tab.6 Effects of different mediums on transplanting survival rates of plantlets

3 小結(jié)

施季森等[9]、樊靖等[13]、龔崢等[14]分別采用楓香無菌種子萌發(fā)后的幼苗下胚軸、5年生單株休眠芽和2年生苗的嫩芽作為試驗(yàn)材料，開展楓香組培快繁試驗(yàn)，均取得了較好的效果。本研究采用早期選擇的優(yōu)良家系中的優(yōu)良單株不同部位的穗條為試驗(yàn)材料，開展楓香組培試驗(yàn)，得出以下結(jié)論：單獨(dú)使用升汞或酒精對楓香莖段進(jìn)行消毒處理，雖然可以起到一定消毒效果，但是二者組合處理更有利于提高萌動率，結(jié)果表明莖段的最佳滅菌方法為70%酒精20 s+0.1%升汞4 min。在增殖培養(yǎng)過程中，6-BA是影響增殖倍數(shù)的主要因素，其次為IAA，以1/2 MS+6-BA 0.9 mg/L+IAA 0.5 mg/L的增殖效果最佳。在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，繼代小芽的長度對生根率有顯著影響，1.1 cm≤L（芽長）≤1.4 cm的楓香繼代小芽更容易生根，生根率高達(dá)95.8%。不同移栽基質(zhì)上的生根苗移栽成活率差異顯著，本次試驗(yàn)以紅心土+泥炭土（1∶1）混合基質(zhì)的移栽效果最佳，移栽成活率達(dá)93%。