真武壯腎湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化防治的實(shí)驗(yàn)研究

劉　莎　張　丹　張義兵

[摘要] 目的:探討中藥真武壯腎湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化防治的效果及機(jī)制。方法:將36只大鼠隨機(jī)分為:假手術(shù)組、模型組、中藥組,采用單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)制作動(dòng)物模型,術(shù)后7、14 d檢測(cè)腎組織TGFβ1及FN的表達(dá)。結(jié)果:中藥組較模型組大鼠腎組織TGFβ1表達(dá)減弱,而FN生成減少。結(jié)論:真武壯腎湯可抑制TGFβ1表達(dá),對(duì)抗腎間質(zhì)纖維化。

[關(guān)鍵詞] 腎間質(zhì)纖維化;真武壯腎湯湯;TGFβ1;FN

[中圖分類號(hào)] R692

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A

[文章編號(hào)] 1674-4721(2009)08(a)-048-02

腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病走向慢性腎衰竭(CRF)的共同病理過程,發(fā)病機(jī)制迄今尚不確切。本研究采用單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,以探討真武壯腎湯防治腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SD雌性大鼠36只,清潔級(jí),體重180～200 g,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、中藥組,每組均為12只,實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水、攝食。

1.2 藥物及試劑

真武壯腎湯(主要由熟附子、茯苓、白芍、白術(shù)、莪術(shù)、三七、生大黃等中藥組成)水煎,分別濃縮成每毫升相當(dāng)于生藥1.0 g(自制),4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

免疫組化超敏SP試劑盒由北京中山公司提供,其余抗體均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)處理

參照文獻(xiàn)以2.5%戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,于左側(cè)腹部切開皮膚,游離左側(cè)輸尿管,分別在腎盂處和輸尿管上1/3處用絲線結(jié)扎后,不切斷輸尿管,逐層縫合皮膚,假手術(shù)組僅游離大鼠左側(cè)輸尿管,不進(jìn)行結(jié)扎。造模前1天開始灌藥,中藥組大鼠分別每日按10.0 g/kg體重灌胃,連續(xù)3周。假手術(shù)組及模型組均給等量生理鹽水灌胃處理。實(shí)驗(yàn)過程均無死亡大鼠,分別于術(shù)后第7、14天各處死6只。

2.2 一般及病理觀察

大鼠處死后,迅速取出左側(cè)腎臟,腎組織經(jīng)4%甲醛浸泡固定,脫水,石蠟包埋,制成約3 μm厚切片,做蘇木素-伊紅染色(HE)。

2.3 免疫組化

用SP法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠腎間質(zhì)TGFβ1及FN的表達(dá),嚴(yán)格按SP試劑盒說明進(jìn)行免疫組化技術(shù)操作。

2.4 計(jì)算機(jī)圖像系統(tǒng)分析

隨機(jī)選取5個(gè)不含腎小球和血管的不重疊視野(×400),以腎間質(zhì)棕褐色染色區(qū)為陽性目標(biāo)區(qū),用彩色多媒體病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度變換后,計(jì)算陽性區(qū)域占該視野面積百分率,以5個(gè)視野的平均值表示纖維化病變程度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用(x±s)表示,采用SSPS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,采用單因素χ2比較。

3 結(jié)果

3.1 一般及病理觀察結(jié)果

假手術(shù)組大鼠左腎未見病理改變,模型組及中藥組第7天出現(xiàn)腎間質(zhì)增寬,炎性細(xì)胞局灶或彌漫性浸潤(rùn)。模型組第14天腎間質(zhì)炎性細(xì)胞彌漫浸潤(rùn),小管上皮細(xì)胞變性、壞死,腎間質(zhì)明顯增寬,皮質(zhì)和外髓萎縮小管較多,纖維化明顯;中藥組同期相比腎間質(zhì)增寬程度減輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,間質(zhì)病變程度明顯減輕。

3.2 各組大鼠FN表達(dá)

與假手術(shù)組比較UUO后腎皮質(zhì)中膠原蛋白的含量明顯升高,見表1,圖1。

3.3 各組腎間質(zhì)TGFβ1表達(dá)

假手術(shù)組大鼠腎組織中僅見腎小球系膜細(xì)胞和小管上皮細(xì)胞表達(dá)較弱的TGFβ1,在模型組及中藥組大鼠TGFβ1廣泛表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿中,而且在纖維化的腎間質(zhì)中亦有較強(qiáng)表達(dá),尤其模型組表達(dá)最強(qiáng)(P<0.05)。見表2,圖2。

4 討論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)并無本病名,據(jù)其發(fā)展過程中的臨床表現(xiàn)及發(fā)病特點(diǎn),我們認(rèn)為其屬于“水腫”、“癃閉”、“關(guān)格”、“腎勞”、“虛勞”、“溺毒”、“尿血”等范疇[1]。本方由真武湯加減而成,真武湯出自《傷寒論》,由附子、茯苓、芍藥、白術(shù)、生姜組成,具有溫陽利水、溫經(jīng)散寒之功效,主治脾腎陽虛、水濕內(nèi)停之證。炮附子大辛大熱,使腎陽得復(fù)、氣化得行;白術(shù),甘苦而溫,燥濕健脾,頗合“脾喜燥惡濕”之性,附子振腎陽于先,姜、術(shù)復(fù)脾陽于后。茯苓助姜、術(shù)之健脾強(qiáng)運(yùn),可淡滲水濕,使陰邪從小便而行。生姜辛而微溫,走而不守,宣肺溫胃,助附子行散溢于肌表之濕。芍藥斂陰護(hù)液,斂陰緩急,一則防姜、術(shù)、附等溫燥之品傷陰之弊。一則《本經(jīng)》載芍藥“能利小便”。加莪術(shù)、三七活血化瘀,生大黃泄?jié)?諸藥配伍,溫脾腎,利水濕,共奏溫陽利水之效。有報(bào)道[2]大黃及其提取物可有效降低腎小管上皮細(xì)胞的增殖,降低其細(xì)胞代謝,從而減輕高代謝狀態(tài)對(duì)健存腎單位的損害。

腎間質(zhì)纖維化是多種原因引起的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分在腎間質(zhì)內(nèi)過度沉積,積聚在腎間質(zhì)的ECM成分復(fù)雜,FN是ECM成分之一,腎間質(zhì)纖維化時(shí)ECM在腎間質(zhì)內(nèi)沉積,在一些因素的刺激下,成纖維細(xì)胞被活化并發(fā)生功能和表形轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)腎小管間質(zhì)骨架蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的肌成纖維細(xì)胞(MFB),后者具有更強(qiáng)的合成ECM的能力,MFB首先分泌FN,為其他ECM成分的沉積和膠原纖維的形成提供支架[3]。

腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生涉及多種細(xì)胞和細(xì)胞因子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),TGF-β是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的促腎間質(zhì)纖維化分子,潛伏的TGF-β可由腎臟固有細(xì)胞或浸潤(rùn)白細(xì)胞產(chǎn)生,大多數(shù)細(xì)胞表面都有TGF-β的受體[4]。于俊生等[5]將60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、正常灌胃組、造模組及造模灌胃組,運(yùn)用單側(cè)輸尿管結(jié)扎法(UUO)制造腎間質(zhì)纖維化模型,術(shù)后5周取術(shù)側(cè)腎臟組織做染色,并應(yīng)用免疫組化檢測(cè)各組大鼠TGFβ1的表達(dá),結(jié)果顯示腎間質(zhì)纖維化后致纖維化因子TGFβ1表達(dá)上調(diào),經(jīng)和絡(luò)泄?jié)岱焦辔负?腎間質(zhì)TGFβ1表達(dá)下調(diào),纖維化程度較造模組顯著改善。Hwang M等[6]的研究表明當(dāng)采用干擾 RNA技術(shù)抑制TGFβ1表達(dá)后,腎間質(zhì)纖維化程度顯著減輕。TGFβ1在腎間質(zhì)纖維化病理過程中的主要作用有刺激細(xì)胞分泌 ECM,抑制 ECM的降解,促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),刺激腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腎間質(zhì)可見ECM大量沉積,TGFβ1表達(dá)顯著增加,出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化,中藥組則腎間質(zhì)沉積的ECM明顯減少,且與TGFβ1表達(dá)變化相一致(P<0.05),腎病理組織檢查也有所改善。

綜上所述,我們認(rèn)為真武壯腎湯可抑制TGFβ1表達(dá),抑制FN等ECM的過度沉積,從而減輕腎小管間質(zhì)的病理性損傷,抑制腎間質(zhì)纖維化的產(chǎn)生,但其具體抗纖維化作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1]晏子友,皮特衡,高書亮,等.化瘀解毒湯對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1及血管緊張素Ⅱ作用的研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,14(2):13.

[2]陳美芳.抗腎間質(zhì)纖維化在腎臟病研究中的新進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,10(6):49-50.

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[5]于俊生,劉海軍.和絡(luò)泄?jié)岱綄?duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1表達(dá)的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2006,7(24):1220-1221.

[6]Hwang M,Kim HJ,Noh HJ,et al.TGF-beta1 siRNA suppresses the tubuloi-nterstitial fibrosis in the kidney of ureteral obstruction[J].ExpMol Pathol,2006,81(8):48-54.