維生素Ｃ陰道緩釋片微生物限度檢查法驗(yàn)證研究

張　洪　李健和　彭六保等

[摘要]目的：建立維生素c陰道緩釋片的微生物限度檢驗(yàn)方法。方法：采用平皿菌落計(jì)數(shù)法、培養(yǎng)基稀釋法、低速離心結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行方法驗(yàn)證。結(jié)果：低速離心結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法回收率明顯高于平皿菌落計(jì)數(shù)法或培養(yǎng)基稀釋法。結(jié)論：低速離心結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法可以用于維生素C陰道緩釋片的微生物限度檢驗(yàn)。

[關(guān)鍵詞]維生素c陰道緩釋片；微生物限度檢驗(yàn)；方法驗(yàn)證

[中圖分類號(hào)]R-331[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1674-4721(2009)05(b)-029-02

細(xì)菌性陰道病是正常寄生在陰道內(nèi)的菌群失調(diào)所致。近年來(lái)有研究表明：將維生素C經(jīng)陰道給藥，維持陰道內(nèi)微酸性條件對(duì)抑制雜菌生長(zhǎng)及防止治療后復(fù)發(fā)有積極意義。德國(guó)Taurus Pharma GmBH公司將規(guī)格為250 mg的維生素C陰道緩釋片(商品名：Vagi-c1在歐洲上市，其臨床上主要用于細(xì)菌性陰道病的治療，同時(shí)可使受破壞的菌群系統(tǒng)恢復(fù)正常。據(jù)此我們立項(xiàng)研制開發(fā)了規(guī)格為250 mg的維生素C陰道緩釋片，以期為國(guó)內(nèi)細(xì)菌性陰道病患者提供一種安全有效的藥物。中國(guó)藥典規(guī)定含抑菌成分的藥品的微生物限度檢查，必須消除供試液抑菌活性后，再根據(jù)中國(guó)藥典規(guī)定的方法進(jìn)行檢查；同時(shí)，所采用的檢測(cè)方法需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以確認(rèn)供試品的抑菌活性和保證測(cè)定方法的可靠性。本文對(duì)維生素C陰道緩釋片的微生物限度檢查進(jìn)行了方法驗(yàn)證，為維生素C陰道緩釋片的微生物限度檢查法提供了科學(xué)依據(jù)。

1一般材料

1.1樣品

維生素C陰道緩釋片由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥劑科和福州海王福藥制藥有限公司共同研制提供。批號(hào)為：20080226、20080227、20080228，規(guī)格為：250 mg，片。

1.2試驗(yàn)茵株

大腸埃希菌fCMCC(B)441021、金黃色葡萄球菌『CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.3培養(yǎng)基及稀釋劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、pH7.0氯化鈉蛋白胨溶液、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供：0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥劑科提供。

2方法及結(jié)果

2.1細(xì)菌、霉菌及酵母茵計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.1.1菌液制備

取經(jīng)35℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物加入到適量的0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液中，稀釋至細(xì)菌數(shù)約為每1毫升含50～100 efu的菌懸液，備用。取經(jīng)25℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物適量加入到適量的O.9％無(wú)菌氯化鈉溶液中，稀釋至細(xì)菌數(shù)為每1毫升含50-100 efu的菌懸液，備用。取經(jīng)25℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加適量0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，取出霉菌孢子懸液倍量稀釋至霉菌數(shù)為每l毫升含50-100 efu的菌懸液，備用。

2.1.2供試品溶液制各

取供試品10g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉一蛋白胨緩沖溶液至100 ml，用研缽法攪勻，制成1:10均勻供試液，備用。

2.1.3試驗(yàn)方法

2.1.3.1試驗(yàn)組：取驗(yàn)證方法項(xiàng)下供試液注入平皿中，加入50～100 cfu試驗(yàn)菌，立即傾注45℃溶化的相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基15ml，搖勻，凝固后，按規(guī)定溫度培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)皿，計(jì)數(shù)其菌落數(shù)。

2.1.3.2菌液組：取試驗(yàn)菌液各1ml，注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)皿，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.1.3.3供試液對(duì)照組：取驗(yàn)證方法項(xiàng)下供試液1 ml，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)皿，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

2.1.3.4稀釋劑對(duì)照組：取稀釋劑1ml替代供試品。立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)皿，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。

2.1.3.5驗(yàn)證試驗(yàn)：按中國(guó)藥典2005年版二部微生物限度檢查法目，進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各次試驗(yàn)菌的回收率。

2.1.3.6菌回收率的計(jì)算：稀釋劑對(duì)照組回收率=(稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)÷菌液組平均菌落數(shù))×100％；試驗(yàn)組菌株回收率=[(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)一供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))÷菌液組菌落數(shù)]x100％。

2.1.4驗(yàn)證方法

2.1.4.1平皿菌落計(jì)數(shù)法：直接取1:10供試液按試驗(yàn)方法注入平皿中進(jìn)行方法驗(yàn)證，計(jì)算其回收率，結(jié)果見表1。

2.1.4.2培養(yǎng)基稀釋法取1:10供試液l m1分別等量注入5個(gè)平皿中(0.2mD，按試驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證，計(jì)算其回收率，結(jié)果見表1。

2.1.4.3低速離心結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法取1:10供試液10 ml置離心管中，以500 r／min離心5 min，取上清液，作為供試液。取此供試液1 m1分別等量注入5個(gè)平皿中(0.2ml)，按試驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證，計(jì)算其回收率，結(jié)果見表1。

2.2控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.2.1金黃色葡萄球菌菌液的制備

接種金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)物用O.9％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1毫升含菌數(shù)為10～100 cfu的菌懸液。

2.2.2銅綠假單胞菌菌液的制備

接種銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35qc培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)物用O.9％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1毫升含菌數(shù)為10～100 cfu的菌懸液。

2.3大腸埃希菌菌液的制備

接種大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃ 培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)物用O.9％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1毫升含菌數(shù)為10～100 cfn的菌懸液。

2.4試驗(yàn)方法和結(jié)果

試驗(yàn)組：取規(guī)定量供試液及10～100 cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)的控制菌檢查方法進(jìn)行檢查(《中國(guó)藥典》2005年版二部微生物檢查法金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌)。陰性菌對(duì)照組：取大腸埃希菌10～100 cfu加入增菌培養(yǎng)基中。結(jié)果：陰性對(duì)照組沒有檢出大腸埃希菌，試驗(yàn)組分別檢出相應(yīng)的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，表明供試品采用《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄ⅪJ微生物檢查法檢查對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響。

3樣品微生物限度檢查

按照《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄XIJ微生物限度檢查法進(jìn)行檢查。三批樣品的檢查結(jié)果見表2。檢查結(jié)果表明：三批樣品微生物限度檢查均符合規(guī)定。

4討論

維生素c分子結(jié)構(gòu)中的3一羥基，由于受共軛效應(yīng)的影響，酸性較強(qiáng)(pKa=4.17)，微酸性條件下可抑制雜菌生長(zhǎng)，具有抑菌作用的藥品可影響微生物限度檢查的準(zhǔn)確性。因此，本課題研究以中國(guó)藥典2005年版二部微生物限度檢查方法驗(yàn)證作為依據(jù)，參考有關(guān)文獻(xiàn)將5種陽(yáng)性對(duì)照菌的回收率試驗(yàn)作為評(píng)價(jià)所采用的方法是否適合于本品種的微生物限度檢查。

回收率結(jié)果表明：維生素C陰道緩釋片對(duì)大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌無(wú)抑制作用，可用常規(guī)法測(cè)定本品中的細(xì)菌數(shù)。本品用平皿菌落計(jì)數(shù)法或培養(yǎng)基稀釋法檢驗(yàn)時(shí)對(duì)污染的白色念珠菌、黑曲霉都有不同程度的抑制作用，影響了菌的生長(zhǎng)，兩種菌的試驗(yàn)組回收率均低于70％，兩種方法都不能完全消除供試品的抑菌成分。當(dāng)采用低速離心結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法檢驗(yàn)時(shí)，由于本品中含有緩釋骨架材料，低速離心除去了這些不溶于緩沖液的骨架材料，使本品中污染的白色念珠菌、黑曲霉回收率有所提高(回收率由培養(yǎng)基稀釋法的65％提高到90％)，說(shuō)明骨架材料部分具有一定的抑菌活性，在實(shí)驗(yàn)中采用低速離心清除了它的抑菌活性，故當(dāng)選用低速離心結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定維生素C陰道緩釋片的細(xì)菌數(shù)時(shí)，回收率大于70％，客觀地反映了藥品污染微生物的狀況。

采用常規(guī)法檢查維生素C陰道緩釋片的控制菌。結(jié)果符合藥典規(guī)定。