一種提高動物源性食品中克倫特羅的檢測精度的方法

黃永生　何玉榆　李湘媛　邱永為

摘? 要：本研究基于液相色譜-串聯(lián)質譜建立了一種高精密度檢測克倫特羅的方法，對所建立的方法進行了方法學的考察與驗證，參考已有的標準，對標準的相關處理步驟進行優(yōu)化，采用液相色譜-串聯(lián)質譜法進行分析。其標準曲線相關系數(shù)為0.999 98，方法檢出限為0.045 5 μg/kg，回收率范圍為93.2%～99.6%，相對標準偏差為1.2%～2.2%。所得結果表明，該方法檢出限低，回收率較好，精準度高，重復性好，可以為檢測動物源性食品中的克倫特羅提供有力的方法支撐。

關鍵詞：克倫特羅;液相色譜-串聯(lián)質譜;高精密度

中圖分類號：S859.84 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2022）04-0088-04

克倫特羅（clenbuterol），化學名為1-（4-氨基-3，5-二氯苯基）-2-（叔丁基-D9-氨基）乙醇，俗稱“瘦肉精”，是一種β2-腎上腺素受體促效劑（β2-adrenergic agonist），臨床上常被用作緩和氣喘急性發(fā)作時的支氣管擴張劑，用于治療哮喘以及休克等疾病[1]。此類藥物對動物脂肪的合成具有抑制作用，進而改變禽畜體內的代謝途徑，有效促進禽畜的肌肉生長和骨骼肌蛋白的合成，提高家畜體內的瘦肉比例，因此常被非法商家當做特殊用途的飼料添加劑加入家畜的飼料中，以提高畜牧生產效益[2]。但是，這種做法會導致動物源性食物中的克倫特羅含量超標，且由于其具有穩(wěn)定的性質，家畜攝入后很難代謝分解，容易在體內聚積，會隨著屠宰后進入市場。在國內外也引發(fā)過一系列的由于克倫特羅殘留導致食物中毒的事件，引起人們的高度重視[3-4]。我國農業(yè)農村部在第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中將克倫特羅及其鹽類物質列為年度監(jiān)測計劃。在第176號等公告明確了在動物飼養(yǎng)過程中禁止使用鹽酸克倫特羅。因此，開發(fā)和研究高效的克倫特羅檢出分析技術一直是食品安全檢測領域的熱點。

當前，動物源性食物中的克倫特羅的檢測主要采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[5]、膠體金免疫層析法[6-7]、表面等離子體共振生物芯片[8]、氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）等[2，9-11]。ELISA靈敏度較高，但易出現(xiàn)假陽性結果，重現(xiàn)性較差;膠體金免疫層析法適合大規(guī)模檢測，但易受環(huán)境因素影響，導致檢查結果存在一定誤差;表面等離子體共振生物芯片適合現(xiàn)場實時連續(xù)快速檢測，但靈敏度較低;GC-MS的處理過程繁瑣效率過低。對此，利用LC-MS檢測克倫特羅就成為了較好的選擇，其擁有高效的分離能力和準確的定性定量能力，具有靈敏度高、所得信息量大、效率較高等優(yōu)點。

本研究參考了農業(yè)農村部1025公告-18-2008《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質譜法》、GB/T21313-2007《動物源性食品中-受體激動劑殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》、GB/T22286-2008《動物源性食品中多種β-受 體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯(lián)質譜在法》[13-15]等，并對上述標準進行了相應的優(yōu)化整合，對動物源性食品中的克倫特羅進行定性與定量分析，優(yōu)化了前處理操作，采用了多種反應監(jiān)測模式測定，有效地提高了工作效率，為動物源性食品中克倫特羅的檢測提供有力的技術支持。

1? 使用材料及操作步驟

1.1 操作儀器與所用試劑

1.1.1 儀器

安捷倫1290液相色譜儀、AB Science質譜儀、漩渦混合儀、電子天平、恒溫水浴搖床、氮吹儀、超純水儀、超聲波清洗機、冷凍離心機、混合型陽離子（mixed-mode cation exchanger，MCX）固相萃取柱（規(guī)格：3 cc，60 mg）。

1.1.2 藥品與試劑

0.2 mol/L乙酸銨（pH=5.2）;0.1 mol/L高氯酸溶液;5%氨化甲醇;甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）;乙酸（分析純）;氫氧化鈉（分析純）;β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶（20 U/mL）;復溶液：甲醇/水/甲酸（10∶90∶0.09，v/v/v）。

1.2? 檢測樣品制備

取適量新鮮肌肉樣品組織，將其攪碎至均勻態(tài)，于-20 ℃避光保存。

1.3? 標液配制

取出克倫特羅的標準品，稱取適量，將其用甲醇配成0.1 mg/mL的標準儲備液，將其置于-20 ℃冰箱中保存，有效期4個月;之后對克倫特羅標準儲備液用甲醇進行逐級稀釋，配制成相應濃度的克倫特羅標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4? 樣品前處理

準確稱取2.00 g（± 0.01 g）試樣，置于50 mL離心管中，加入8.0 mL 0.2 moL/L乙酸銨溶液（pH=5.2）和40 ?L β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶（20 U/mL），加蓋2 000 r/min渦旋振蕩8 min，37 ℃恒溫搖床避光酶解18 h。酶解后放置至室溫，在酶解液中加入300 ?L高氯酸（將pH調至1.00），渦旋30 s，10 000 r/min 低溫離心5 min，移上清液于另一離心管中。在殘渣中加入2 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，渦旋30 s，10 000 r/min低溫離心5 min，合并上清液。上清液中加入570 μL 5 mol/L的NaOH（將pH調至4.00），備用。

MCX固相萃取柱分別依次用5 mL甲醇、5 mL水活化。取備用液全部過柱，再依次用5 mL水、5 mL甲醇淋洗小柱，抽干。用5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集至15 mL塑料離心管。洗脫液在50 ℃下氮氣吹干，加入復溶液將吹干后洗脫液定容至1.00 mL，渦旋劇烈震蕩5 min，使用1 mL注射器過0.22 μm的濾膜，供液質聯(lián)用儀測定。

2? 結果與討論

2.1 標準曲線

按照農業(yè)農村部1025號公告-18-2008《動物源性食品中β–受體激動劑殘留檢測? 液相色譜–串聯(lián)質譜法》標準設置儀器條件，配制一系列濃度的標準樣品溶液（0.25 ?g/kg、? 0.50 ?g/kg、1.00 ?g/kg、2.50 ?g/kg、? ? ?5.00 ?g/kg），待儀器條件合適后，對標液進行測定，對得到的數(shù)據(jù)進行標準曲線的繪制，其相關系數(shù)為R2=0.999 98。

2.2 方法檢出限測定

以空白的畜禽肌肉樣品作為基質，制作陽性樣，濃度C（0.25 ?g/kg），按照上述的方法進行前處理操作，之后用液質聯(lián)用儀測定，測得克倫特羅的信噪比為S/N=16.5，由此得到其檢出限為0.045 5 ?g/kg。

2.3 回收率及精密度確定

以空白畜禽肌肉組織為基質，進行加標回收率測定試驗，加標濃度分別為0.25 ?g/kg、1.00 ?g/kg、2.50 ?g/kg。將加標后的樣品及空白的組織樣品按照前處理的方法操作，上機進行測試，得到相應的精密度及回收率結果如表1、表2所示。根據(jù)表1與表2中相對標準偏差和回收率結果可發(fā)現(xiàn)，該方法的相對標準偏差較低，且回收率表現(xiàn)較好，克倫特羅的回收率范圍為93.2%～99.6%，相對標準偏差為1.2%～2.2%。該方法的檢出限較低、重復性較好，也能保持較為優(yōu)異的回收率，可用于克倫特羅的定性、定量檢測。

3? 結論

本研究提出了一種高效檢測克倫特羅的方法，優(yōu)化了相關標準提取步驟，采用乙酸銨對酶解后的畜禽肌肉組織進行提取，得到的溶液通過離心后取上清液進行過柱凈化，利用液質聯(lián)用儀進行測定。整個過程所進行操作簡單，前處理時不需要太精密的儀器，同時所需的有機試劑較少。結果表明，該方法的檢出限低，回收率較好，且重復效果好，有效地消除了基質效應的干擾，提高了克倫特羅的方法檢測的準確性及精密度，有效地節(jié)約了檢測的成本與時間，提升了檢測的效率。通過不同中的抽檢樣品的實際測試證明，本方法適用于絕大多數(shù)畜禽肌肉組織中克倫特羅的快速定性、定量檢測。

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