釀酒酵母與擬南芥Ｐｒｅ－ｍＲＮＡ剪接位點(diǎn)的比較

申杰華

摘要：RNA 剪接是一個(gè)多步驟、形成多種中間狀態(tài)復(fù)合物的復(fù)雜過(guò)程?？缥锓N的基因表達(dá)更顯得復(fù)雜，RNA剪接是基因表達(dá)調(diào)控中重要的步驟。這里討論酵母和植物的剪接位點(diǎn)保守序列的差異，指出可能對(duì)植物基因在酵母中表達(dá)有重要作用的順式作用元件。

關(guān)鍵詞：RNA剪接；剪接體；剪接因子；跨物種表達(dá)；剪接位點(diǎn)

釀酒酵母細(xì)胞繁殖快，操作簡(jiǎn)便，屬于真核模式生物。將植物的基因放入酵母中表達(dá)，在于能用酵母細(xì)胞大量表達(dá)植物蛋白。在2002年有一篇論文關(guān)于植物mRNA前體在裂殖酵母中的剪接和1983年的跨物種基因表達(dá)的研究。[1]

RNA剪接(RNA splicing)是tRNA、rRNA，特別是mRNA加工與成熟的重要生物學(xué)過(guò)程，也是蛋白質(zhì)分子多樣性產(chǎn)生的關(guān)鍵機(jī)制之一，在基因表達(dá)調(diào)控中扮演著重要的角色[2]。RNA剪接需要多種因子參與， 包括雜性核RNA(heterogeneous nuclear I A，hnRNA)結(jié)合蛋白hnRNP(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)、小型核RNA (small nuclear RNA，snRNA)結(jié)合蛋白snRNP(small nuclear ribonucleoprotein)等。核pre-mRNAs 剪接由剪接體執(zhí)行，剪接體包含有5種（U1,U2,U4/6,和U5）snRNPs和其他non-snRNP剪接因子。[3]在真核細(xì)胞內(nèi)，RNA原初轉(zhuǎn)錄物的分子很大，通過(guò)剪接產(chǎn)生成熟的mRNA分子．

1Pre-RNA剪接反應(yīng)機(jī)制概述

真核生物細(xì)胞核基因初始轉(zhuǎn)錄物(pre-mRNA)剪接由兩步連續(xù)進(jìn)行的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)完成(Padgett，1984Ruskin，1984)。首先，分支位點(diǎn)(branch site)處的腺苷酸2羥基親核攻擊5剪接位點(diǎn)的3一5磷酸二酯鍵，產(chǎn)生兩種剪接中間體分子：一為5外顯子對(duì)應(yīng)的線性RNA分子；一為由內(nèi)含子5一端鳥苷酸與分支點(diǎn)腺苷酸之間通過(guò)2一5磷酸二酯鍵形成的套索狀分子，該分子包含了內(nèi)含子和3外顯子序列。緊接著5一外顯子的3羥基攻擊3剪接位點(diǎn)的磷酸二酯鍵，去除套索狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子序列，同時(shí)將相鄰的兩個(gè)外顯子連接起來(lái)[4]。

2剪接體組裝中的內(nèi)含子和外顯子的界定

U1snRNP結(jié)合上5剪接位點(diǎn)SF1結(jié)合到分支區(qū)域促使U2AF結(jié)合到聚嘧啶區(qū)域和3剪接位點(diǎn)上，導(dǎo)致早期復(fù)合體的形成（E complex）。在A復(fù)合體中U2snRNP和mRNA 前體形成穩(wěn)定的snRNA-branch-region duplex。U4-U5-U6 3snRNP結(jié)合到A復(fù)合體上產(chǎn)生C復(fù)合體，一個(gè)成熟的剪接體。（1）內(nèi)含子界定：mRNA 前體含有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子，在E復(fù)合體上的剪接因子結(jié)合在剪接位點(diǎn)上跨過(guò)內(nèi)含子。（2）外顯子界定：在mRNA 前體中含有多個(gè)內(nèi)含子和外顯子，E復(fù)合體中的剪接因子結(jié)合在剪接位點(diǎn)上在外顯子定義的早期復(fù)合體上（EDE complex）,隨后形成了A復(fù)合體（EDA complex），在組裝成熟剪接體的過(guò)程中有一個(gè)內(nèi)含子界定的復(fù)合體的過(guò)渡[5]。

3剪接體的組裝過(guò)程

mRNA 前體原始轉(zhuǎn)錄物被蛋白（hnRNP Proteins;putative AU-biding proteins in plants）結(jié)合上,這類蛋白中的一些可能會(huì)結(jié)合上特殊的序列或者結(jié)合剪接因子.U1snRNP 和蛋白的相互作用（比如U2AF）形成一個(gè)復(fù)合體。結(jié)合U2 snRNP形成剪接體的前體，再結(jié)合上U4/U6-U5就形成了剪接體。隨著這個(gè)復(fù)合體一系列的RNA-RNA間的相互作用和重組的改變，剪接反應(yīng)發(fā)生了。剪接后，間接產(chǎn)物和剪接后復(fù)合體被釋放，內(nèi)含子被降解，剪接體結(jié)合在內(nèi)含子上而后進(jìn)入新的一輪循環(huán)中[6]。

4mRNA前體剪接因子

4.1 SR蛋白

SR蛋白家族是近些年來(lái)為人們廣泛關(guān)注的一類剪接因子，它在剪接復(fù)合體的聚集形成，以及剪接因子在mRNA前體鏈上結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。其成員包括SC35(spliesome component of 35kD)、SF2/ASF(splicing factor 2/alternative splicing factor)、SRP20、SRP30、SRP40、SRP55和SRP70等。SR 家 族 剪接因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是氨基酸序列中富含絲氨酸一精氨酸殘基。其中RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RNA binding domain)位于氨基末端(N末端)，具有結(jié)合RNA的能力。而位于竣基末端的是含不同絲氨酸和精氨酸殘基數(shù)量的RS 結(jié)構(gòu)域(RS domain)，它能夠與具有RS結(jié)構(gòu)域的U2AF(U2 auxiliary factor)的35kD亞基和U1snRNP7OkD的蛋白質(zhì)相互作用，因而能夠促進(jìn)U2AF和U1snRNP與剪接位置結(jié)合。所以，SR蛋白在高等真核生物細(xì)胞中介導(dǎo)U1snRNP同5剪接位點(diǎn)結(jié)合與U2AF同3'剪接位點(diǎn)結(jié)合，起著“橋”的作用。關(guān)于SR蛋白在選擇性剪接中對(duì)剪接位點(diǎn)的調(diào)控，主要是通過(guò)與不同的幾個(gè)順式調(diào)節(jié)因子作用。如通過(guò)與外顯子的剪接增強(qiáng)子(exonic splicing enhancer，ESE)、內(nèi)含子的剪接增強(qiáng)子(intronic splicing enhancer，ISE)、外顯子的剪接沉默子(exomcsplicing silencer，ESS)和內(nèi)含子的剪接沉默子(Intronic splcing silencer，ISS)的結(jié)合，來(lái)增強(qiáng)或減弱對(duì)其附近3或5弱剪接位點(diǎn)的識(shí)別和利用[7]。Wang等[8]使用ESE finder的軟件(web一based)，對(duì)人類SR蛋白可識(shí)別的細(xì)胞中存在著的ESE序列進(jìn)行篩選和評(píng)分，這些蛋白質(zhì)包括SF2/ASF、SRP40、SRP55和SC35;進(jìn)一步證實(shí)了與ESE序列相關(guān)的SR蛋白，在外顯子的定位過(guò)程以及組成性剪接和選擇性剪接過(guò)程中的重要作用。另一方面，人類的很多疾病都與SR蛋白非正常結(jié)合剪接位點(diǎn)有關(guān)。Stickeler等[9]對(duì)腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤形成之前，不同組織細(xì)胞中SR蛋白的表達(dá)類型各不相同，一般只表達(dá)1個(gè)家族中的1個(gè)亞型;隨著腫瘤的發(fā)展，SR蛋白表達(dá)類型逐漸增多而各不相同。以至最后，惡性腫瘤中SR蛋白的表達(dá)類型變得十分復(fù)雜。另外，Li等[10]發(fā)現(xiàn)SR蛋白SF2/ASF在維持基因組的穩(wěn)定方面也起作用。

4.2 hnRNP形成因子

多聚嘧啶區(qū)域結(jié)合蛋白(PTB)是一種分子量為58kD的可以與RNA結(jié)合的新型核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNp)形成因子，它參與各種與RNA代謝相關(guān)的過(guò)程，也包括RNA的剪接。PTB能與U2AF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合多聚嘧啶區(qū)域，對(duì)3剪接位點(diǎn)起調(diào)控作用。PTB也能抑制5剪接位點(diǎn)，并且可能通過(guò)包裹外顯子使其不被剪接體結(jié)合而使外顯子被跳過(guò)。

hnR N P A1也是一類hnRNP形成因子，有人對(duì)其進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)分析表明，它有兩個(gè)獨(dú)立折疊的與RNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，兩者之間有一個(gè)連接體。兩個(gè)RNA結(jié)合域(RNA binding domain，RBD)對(duì)于U1部分區(qū)域具有很高的同源性，這可以解釋兩者之間的對(duì)于剪接位點(diǎn)結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。而在空間位置上，兩個(gè)RBD呈反平行排列且彼此靠近，構(gòu)成RNA結(jié)合平臺(tái)，依靠?jī)蓪?duì)Arg一AsP離子鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定。這種反平行RNA結(jié)合平臺(tái)的存在，使得RNA能夠形成濃縮狀態(tài)結(jié)合并集聚于平臺(tái)上，從而有利于RNA分子的剪接和運(yùn)輸[10]。

4.3 RNA解旋酶類剪接因子

在酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一類需要水解特定的核苷三磷酸進(jìn)而發(fā)揮其功能的剪接因子。其中的代表是特定氨基酸位點(diǎn)是天冬氨酸一谷氨酸一隨機(jī)氨基酸一組氨酸/天冬氨酸基序的核苷三磷酸酶(Asp一Glu一x一His/Asp box NTPase，DExH/D一box NTPase)。這類蛋白質(zhì)因子具有“解旋酶”的結(jié)構(gòu)域，有類似于核酸蛋白酶(RNPases)的功能，且極為保守。屬DExH/D一box NTPases蛋白家族的成員有Prps、Prp2、Prpl6、Prp22和Prp43等。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，人們發(fā)現(xiàn)Ppr5對(duì)于剪接復(fù)合體的聚合至關(guān)重要，Prp2催化復(fù)合體構(gòu)象的改變以順應(yīng)第一步的RNA酯交換反應(yīng)，Prpl6p參與第二步的RNA酯交換反應(yīng)，Prp22p在mRNA的釋放過(guò)程中發(fā)揮作用，而內(nèi)含子的釋放與Prp43的參與有關(guān)。另外，Prp28和Brr2是U5snRNP中的兩個(gè)DExH/D一box ATPase，它們?cè)赨1和U4snRNP從剪接復(fù)合體中釋放過(guò)程中起作用[11]。對(duì)于剪接復(fù)合體來(lái)說(shuō)，在完成一輪的剪接反應(yīng)后解聚是很有必要的，因?yàn)檫@對(duì)于參與剪接的蛋白質(zhì)因子的重新利用而促進(jìn)下一輪的剪接反應(yīng)很重要。

在剪接催化過(guò)程中，U5snRNP扮演了重要角色，而Snull4和Prp8似乎是組成了U5snRNP的核心。其中，Snull4和核糖體轉(zhuǎn)運(yùn)酶(translocase)EF一G有很高的同源性，Small等[12]發(fā)現(xiàn)，Snull4催化GTP水解然后引發(fā)剪接復(fù)合體激活和解聚。

另外，人們發(fā)現(xiàn)一種蛋白復(fù)合體Ppr19，又稱NTC(NineTeen complex)，在剪接過(guò)程中加到原先的剪接復(fù)合體上[13]。對(duì)于U1或者U4的解離，NTC并非必需，但是它們可在U4的解離后在剪接復(fù)合體上穩(wěn)定U5和U6，使得U5和U6與mRNA前體形成一種高度易于催化反應(yīng)的狀態(tài)。這表明，NTC在調(diào)節(jié)復(fù)合體結(jié)構(gòu)改變過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。利用基因工程的方法，目前已鑒定出8種蛋白質(zhì)因子參與了NTC的組成。這些蛋白質(zhì)因子是在U4脫離剪接復(fù)合體后一起加到復(fù)合體上去的，提示這些蛋白質(zhì)可能以整體的一個(gè)復(fù)合體的形式發(fā)揮功能。

5釀酒酵母和擬南芥的剪接順式作用元件保守序列的比較（14）：

上圖中A表示5剪接位點(diǎn)，B表示分支位點(diǎn)，C表示3剪接位點(diǎn)。每個(gè)字母的高低對(duì)應(yīng)著堿基在相應(yīng)位置出現(xiàn)的頻率。比較酵母和擬南芥5剪接位點(diǎn)和分支位點(diǎn)，不難發(fā)現(xiàn)擬南芥相對(duì)酵母堿基出現(xiàn)的頻率沒(méi)酵母的高，相對(duì)來(lái)說(shuō)剪切位點(diǎn)堿基保守性不高。所以從序列保守性來(lái)看，5剪接位點(diǎn)和分支位點(diǎn)是擬南芥植物基因在酵母中表達(dá)比較重要順式作用元件。

6展望與結(jié)語(yǔ)

在多數(shù)情況下，真核mRNA內(nèi)含子的存在可以提高基因的表達(dá)水平，因?yàn)槠浼艚舆^(guò)程會(huì)影響mRNA新陳代謝的多個(gè)階段，包括轉(zhuǎn)錄、RNA編輯、pre-mRNA的加工、mRNA的出核運(yùn)輸、翻譯和無(wú)義衰變等。真核mRNA內(nèi)含子在真核生物基因表達(dá)調(diào)控中起著重要的作用，是轉(zhuǎn)基因研究中提高外源基因表達(dá)的重要元件之一。

植物內(nèi)含子序列在3剪接位點(diǎn)前沒(méi)有聚嘧啶序列（polypyrimidine tract），也沒(méi)有保守的分支位點(diǎn)序列和酵母比較。然而，植物內(nèi)含子富含AU 序列在3剪接位點(diǎn)前。AU-rich 序列在酵母中可能和在植物中的作用相似，能幫助剪接因子識(shí)別其他的順式作用元件例如剪接位點(diǎn)。植物內(nèi)含子在酵母中表達(dá)的過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)提前和隱藏剪接位點(diǎn)等復(fù)雜的問(wèn)題。

植物基因在酵母中的表達(dá)具有重要的意義，可應(yīng)用于工程菌，對(duì)跨物種基因表達(dá)也具有重要的作用。

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