毛細(xì)管電泳法分離9種磺胺類藥物

(1.深圳市福田區(qū)疾病預(yù)防控制中心，深圳 518040；2.深圳大學(xué)藥學(xué)院，深圳 518060；3.深圳市寶安區(qū)疾病預(yù)防控制中心，深圳 518100)

磺胺類(sulfonamides)藥物在1932年被德國(guó)的杜馬克首次應(yīng)用[1]，是一類含有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)藥物的總稱，主要通過(guò)與對(duì)氨基苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合二氫葉酸合成酶，影響細(xì)菌核蛋白合成而發(fā)揮抑菌作用[2，3]，該類藥物已有超過(guò)70 年的使用歷史，具有抗菌譜廣、價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，無(wú)論在臨床還是獸藥領(lǐng)域，該類藥物均有著極其廣泛的應(yīng)用[4-6]。目前磺胺類藥物的檢測(cè)方法有高效液相色譜法(HPLC)[7-12]、免疫膠體金法[13]、ELISA 檢測(cè)試劑盒法[14]、薄層色譜法[15]以及高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[16]等。在磺胺類藥物的HPLC分離中，除了甲醇和乙腈等流動(dòng)相，還需要添加乙酸等物質(zhì)來(lái)改善拖尾[17-20]，較為繁瑣，且HPLC自身的溶劑消耗量較大，污染大。

毛細(xì)管電泳(CE)兼有高壓電泳及微柱液相分析的特點(diǎn)，其運(yùn)行溶液多為水和無(wú)機(jī)鹽，樣品消耗量在納升級(jí)別，具有分析速度快、分離效率高(比HPLC高1～2數(shù)量級(jí))、分離模式多，樣品和試劑消耗少、污染小等特點(diǎn)，是一種低運(yùn)行成本的高效分離方法。文獻(xiàn)報(bào)道的磺胺類藥物CE分析方法中，部分需要特殊的檢測(cè)器，如電導(dǎo)或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)裝置[21-25]，或復(fù)雜的緩沖溶液體系[26，27]，分離對(duì)象多局限于3種左右的磺胺類藥物。本實(shí)驗(yàn)建立了直接以磷酸鹽緩沖液為運(yùn)行溶液，同時(shí)測(cè)定多達(dá)9種磺胺類藥物的方法，并用于滴眼液和獸藥藥粉中相應(yīng)藥物成分的含量測(cè)定，取得了良好效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(Beckman Coulter instruments，F(xiàn)ullerton，CA，USA)，配備二極管陣列檢測(cè)器、32Karat 7.0工作站；熔融石英毛細(xì)管(河北永年光纖廠)，內(nèi)徑75μm，外徑365μm；磁力攪拌器(IKARCT基本型)；酸度計(jì)(型號(hào)S20)；蝸旋混勻器(型號(hào)MS3)；超聲儀(Elmasonic S 100H，Germany)；氫氧化鈉、鹽酸、十水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、硼砂、硼酸、檸檬酸鈉和檸檬酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺甲噻二唑、磺胺間二甲氧嘧啶對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；思芬牌磺胺醋酰鈉滴眼液購(gòu)自武漢五景藥業(yè)有限公司(批號(hào)17080201)；博立達(dá)牌復(fù)方磺胺氯噠嗪鈉粉購(gòu)自江西博萊大藥廠有限公司(批號(hào)20170609)。

1.2 緩沖液及樣品制備

緩沖液配置方法如下: 分別配制pH 5.5、6.5、7.5和9.0的20mmol/L磷酸鹽緩沖液，20mmol/L硼砂-硼酸緩沖液和20mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品制備方法如下：分別取適量磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺甲噻二唑、磺胺間二甲氧嘧啶粉末，以50%甲醇溶液為溶劑配置成不同的濃度。

磺胺醋酰鈉滴眼液樣品制備方法如下：取滴眼液1.0mL，用50%甲醇溶液定容至1.0 L，搖勻。然后取1.0mL，用50%甲醇溶液定容至10mL，過(guò)0.2μm濾膜，進(jìn)樣分析。

復(fù)方磺胺氯噠嗪鈉粉樣品制備方法如下：取樣品約0.5 g，精密稱定，置100mL量瓶中，加水50mL，然后攪拌5min，超聲5min，加甲醇50mL，搖勻；精密量取5mL，置500mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻；過(guò)0.2μm濾膜，進(jìn)樣分析。

1.3 毛細(xì)管電泳分析方法的建立

毛細(xì)管電泳分析條件如下：137.9 kPa壓力下，用0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L NaOH、水、電泳緩沖液沖洗毛細(xì)管各5分鐘，預(yù)電泳平衡5分鐘。樣品在3.45 kPa壓力下進(jìn)樣3秒，然后電泳分離，柱溫為20℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 電解質(zhì)種類對(duì)9種磺胺類藥物分離效果的影響

考察電解質(zhì)種類對(duì)分離效果的影響，結(jié)果如圖1所示。在20 mM磷酸鹽緩沖溶液中，21min以內(nèi)9種磺胺類藥物基本分離，各峰峰型對(duì)稱尖銳，柱效高，分離效果較好。在20 mM硼砂緩沖溶液中，電滲流增強(qiáng)，分析時(shí)間縮短至12分鐘，但各組分的分離度降低，大量組分無(wú)法分離，且峰高降低。在20mM檸檬酸鹽緩沖溶液中，不僅分析時(shí)間延長(zhǎng)至30min，各峰的峰寬明顯增加，分離效率下降，組分之間出現(xiàn)了峰合并。

綜上所述，選擇磷酸鹽緩沖液作為優(yōu)化的運(yùn)行緩沖液。為了確定各峰的歸屬，分別將各個(gè)磺胺藥物進(jìn)行電泳分析。通過(guò)比對(duì)遷移時(shí)間、峰形與紫外可見(jiàn)吸收光譜(190nm～600nm范圍)，得到磷酸鹽電泳緩沖液中9種磺胺藥物的歸屬，如圖1所示。

2.2 緩沖液pH值對(duì)磺胺類藥物分離效果的影響

緩沖液pH值影響著分析物的電泳淌度和電滲流大小，是電泳過(guò)程中重要的優(yōu)化參數(shù)。研究考察了在磷酸鹽緩沖溶液中，pH 5.5～9.0的范圍內(nèi)，9種磺胺類藥物的分離效果，結(jié)果如圖2所示。在偏酸性(pH5.5)或堿性(pH9.0)的條件下，磺胺類藥物的出峰數(shù)目減少，并出現(xiàn)峰合并現(xiàn)象。在pH6.5 條件下，磺胺二甲嘧啶和磺胺氯噠嗪無(wú)法分離。在pH7.5條件下，9種磺胺類抗生素得到基本分離，分離效果較好。因此選擇pH為7.5的磷酸鹽緩沖溶液作為優(yōu)化的電泳條件。

圖1 電解質(zhì)種類對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品分離效果的影響各標(biāo)準(zhǔn)品濃度: 0.02 mg/mL; 電壓: 8 kV; pH值: 7.5峰鑒定: 1.磺胺二甲嘧啶; 2.磺胺氯噠嗪; 3.磺胺吡啶; 4.磺胺醋酰; 5.磺胺噻唑; 6.磺胺甲基嘧啶; 7.磺胺喹惡啉; 8.磺胺甲噻二唑; 9.磺胺間二甲氧嘧啶.

圖2 緩沖液pH值(磷酸鹽緩沖溶液)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品分離效果的影響各標(biāo)準(zhǔn)品濃度: 0.02 mg/mL; 電壓：8 kV峰鑒定: 1.磺胺二甲嘧啶; 2.磺胺氯噠嗪; 3.磺胺吡啶; 4.磺胺醋酰; 5.磺胺噻唑; 6.磺胺甲基嘧啶; 7.磺胺喹惡啉; 8.磺胺甲噻二唑; 9.磺胺間二甲氧嘧啶.

2.3 不同分離電壓對(duì)磺胺類藥物分離效果的影響

分離電壓直接影響毛細(xì)管內(nèi)電滲流和分析物電遷移速率的大小，從而影響分析時(shí)間和分離效率。研究考察了在pH7.5的磷酸鹽緩沖液中，分離電壓5 kV～12 kV范圍內(nèi)，9種磺胺類藥物分離效果。結(jié)果如圖3所示。當(dāng)分離電壓為5 kV時(shí)，分析時(shí)間長(zhǎng)達(dá)37mins，9種磺胺類藥物峰型過(guò)寬，柱效較低。當(dāng)分離電壓為8 kV時(shí)，分析時(shí)間幾乎縮短一半，9種磺胺類抗生素峰形尖銳，分離情況最好。當(dāng)分離電壓為12 kV時(shí)，雖然分析時(shí)間縮短至15min，但分離度下降明顯。因此，選擇8 kV作為優(yōu)化的電壓條件。

圖3 分離電壓對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品分離效果的影響各標(biāo)準(zhǔn)品濃度: 0.02 mg/mL; pH值:7.5峰鑒定: 1.磺胺二甲嘧啶; 2.磺胺氯噠嗪; 3.磺胺吡啶; 4.磺胺醋酰; 5.磺胺噻唑; 6.磺胺甲基嘧啶; 7.磺胺喹惡啉; 8.磺胺甲噻二唑; 9.磺胺間二甲氧嘧啶.

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

對(duì)5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL和60 μg/mL的9種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行電泳分析，以濃度(μg/mL,X)對(duì)峰高(Y)進(jìn)行線性回歸，9種物質(zhì)線性關(guān)系良好。以3倍信噪比(S/N)對(duì)應(yīng)分析物濃度作為檢出限，10倍信噪比對(duì)應(yīng)分析物濃度作為定量限，9種磺胺藥物的相關(guān)數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 9種磺胺類藥物線性回歸數(shù)據(jù)、檢出限和定量限

2.5 樣品測(cè)定

為了考察方法在藥物含量檢測(cè)中的應(yīng)用，測(cè)定了獸藥藥粉中磺胺氯噠嗪鈉以及滴眼液中磺胺醋酰鈉的含量。博立達(dá)牌復(fù)方磺胺氯噠嗪鈉粉購(gòu)自江西博萊大藥廠有限公司(批號(hào)20170609)，包裝標(biāo)識(shí)規(guī)格：1000 g藥粉含磺胺氯噠嗪鈉625 g和甲氧芐啶125 g。藥粉經(jīng)簡(jiǎn)單溶解和稀釋后，可以直接進(jìn)樣分析，其樣品電泳圖如圖4(a)所示，該藥粉的輔料及其他成分不影響檢測(cè)，雜峰與目標(biāo)峰完全分離，用本方法測(cè)得藥粉中磺胺氯噠嗪鈉的含量為0.619 g/g，與標(biāo)示量(0.625 g/g)基本相符。思芬牌磺胺醋酰鈉滴眼液購(gòu)自武漢五景藥業(yè)有限公司(批號(hào)17080201)，滴眼液稀釋后進(jìn)樣，只有目標(biāo)峰出現(xiàn)，無(wú)任何干擾峰，用本方法測(cè)得滴眼液中磺胺醋酰鈉含量為0.142 g/mL，與標(biāo)示量(0.15g/mL)基本相符。

圖4 復(fù)方磺胺氯噠嗪鈉粉樣品電泳圖(a).復(fù)方磺胺氯噠嗪鈉粉樣品；(b).磺胺醋酰鈉滴眼液樣品；(c).9種磺胺藥物混合標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品濃度：0.02 mg/mL峰鑒定: 1.磺胺二甲嘧啶; 2.磺胺氯噠嗪; 3.磺胺吡啶; 4.磺胺醋酰; 5.磺胺噻唑; 6.磺胺甲基嘧啶; 7.磺胺喹惡啉; 8.磺胺甲噻二唑; 9.磺胺間二甲氧嘧啶.

3 討論與小結(jié)

使用毛細(xì)管電泳和DAD檢測(cè)器，建立了同時(shí)檢測(cè)9種磺胺類藥物的方法。在優(yōu)化的電泳條件下，9種磺胺類藥物成分基本分離，具有良好的線性關(guān)系。使用該方法測(cè)定了眼藥水和獸藥藥粉中磺胺類藥物含量，與標(biāo)示含量一致。本方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，適用于磺胺類藥物成分的快速檢測(cè)。

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