海南銅鼓嶺熱帶濱海森林樹干地衣真菌群落的分析

高博鈺，楊小波，李英英，李東海，張 麗，宋佳昱

(海南大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)院， ?？?570228)

地衣是真菌與藻類經(jīng)過長期演化而形成的共生聯(lián)合體，是生物多樣性的重要組成部分[1]。能與藻共生形成地衣的特殊真菌稱為地衣化真菌(lichenized fungi)[2]，其中真菌形態(tài)決定了地衣的形態(tài)特征。地衣的生長基物非常廣泛，人們常把生長在樹木上的地衣稱為樹生地衣[3]。樹生地衣又分為樹干地衣和樹冠地衣。在寒冷地區(qū)的森林里，以大型的枝、葉狀地衣為主，雖然種類較少，但個(gè)體的量相對(duì)較多；在熱帶、亞熱帶的森林里，常見的地衣多為殼狀地衣，雖然種類豐富，但個(gè)體的量相對(duì)較少[4]，而且在不同地區(qū)或同一地區(qū)不同海拔或不同森林類型中，種類也有較大的差別。鐵軍等[5]的研究結(jié)果表明，在神農(nóng)架千家坪川金絲猴棲息地的森林中，海拔1 850～2 000 m間的樹干地衣物種多樣性最高；艾尼瓦爾·吐米爾等的研究結(jié)果表明，在阿勒泰東部山區(qū)森林中，樹干地衣種類豐富度最大的海拔范圍在1 650～1 800 m之間[6]。樹皮的理化性質(zhì)也能影響地衣的豐富度，BATES等[7]的研究結(jié)果表明，英格蘭西南部沿海地區(qū)樹干地衣分布偏好性主要由樹皮酸度決定?？偠灾?，森林中樹干地衣的分布和群落組成與濕度、郁閉度、光照強(qiáng)度和海拔高度[5-6,8-12]等諸多環(huán)境因素有關(guān)，也與森林樹木的年齡和樹皮的理化性質(zhì)等宿主因素有關(guān)[5-7,9-11,13-18]。因此，仍需要更多的研究案例，從不同角度來解釋地衣與各項(xiàng)因素間錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系。筆者在海南東北部沿海低丘陵地區(qū)的銅鼓嶺，選擇同一坡向、同一海拔的自然森林樣地，通過定位采樣采集森林群落重要值較大的前20個(gè)樹種的樹干地衣，并通過真菌DNA條形碼技術(shù)對(duì)地衣進(jìn)行物種鑒定，旨在了解以銅鼓嶺為代表的熱帶濱海森林樹干地衣的種類組成、水平分布特點(diǎn)以及它們與宿主種類、宿主樹干高度之間的相互關(guān)系，為全面了解森林群落樹干地衣多樣性的形成機(jī)制及其與生境或宿主之間的相互作用等研究提供參考。

1 研究區(qū)概況與研究方法

1.1 研究區(qū)概況銅鼓嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)地處海南島東北部文昌市境內(nèi)的濱海低丘陵基巖海岸地帶[19]，位于19°37′20″～19°41′10″N，111°00′00″～111°02′30″E之間，處熱帶北緣地區(qū)。保護(hù)區(qū)內(nèi)有18座山峰，主峰海拔338 m[20]，保護(hù)區(qū)面積1 050 hm2，其中核心區(qū)面積500 hm2。由于受熱帶季風(fēng)性氣候和熱帶海洋性氣候的雙重影響，保護(hù)區(qū)云霧多，風(fēng)速大(月平均風(fēng)速為8～10 m·s-1)的氣候特點(diǎn)；年均氣溫23～24 ℃，年均降水量1 721.6 mm，年均蒸發(fā)量1 872.7 mm，全年日照時(shí)數(shù)2 137 h[19]。

銅鼓嶺山地坡度大多陡峭，土壤以磚紅壤為主，土層淺薄，土壤發(fā)育程度低[19-21]；分布有熱帶濱海森林(喬木林和灌木林)和海岸草叢等自然植被，其中，熱帶濱海森林為該保護(hù)區(qū)的主要植被類型，也是保護(hù)區(qū)的重點(diǎn)保護(hù)對(duì)象之一。該森林群落內(nèi)部物種豐富，多數(shù)植株胸徑和高度都較小，分層不明顯，因此也被稱為“矮林”[22]。

1.2 樣品采集在銅鼓嶺向海側(cè)坡面的森林中，建立160 m×160 m的固定樣地，將大樣地劃分為64個(gè)20 m×20 m的小樣方(圖1)，選擇了大樣地內(nèi)重要值較大的前20個(gè)樹種的樹干地衣為對(duì)象(重要值前20的立木株數(shù)占據(jù)了95.9 %)，樣地內(nèi)森林群落樹木組成重要值計(jì)算結(jié)果見表1。樹干地衣的取樣位置集中于樹干距地面0～2.0 m的位置。將采集到的地衣分裝在干凈的封口袋，記錄編號(hào)、采集地點(diǎn)的坐標(biāo)、海拔數(shù)據(jù)。帶回實(shí)驗(yàn)室共217份樣品，將樣品存放于-80 ℃的冰箱內(nèi)，作為后期分子檢測(cè)的材料。

表1 銅鼓嶺熱帶基巖海岸丘陵森林前20個(gè)群落物種的重要值

1.3 主要儀器和試劑儀器：超低溫冰箱(NBS公司)、冰箱(海爾)、制冰機(jī)(GRANT)、電子天秤(奧豪斯)、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)、5415R冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf)、生化培養(yǎng)箱MP-160B型(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、梯度PCR擴(kuò)增儀(Biometra)、電泳儀DYY-11型(北京市六一儀器廠)、電泳槽(BAYGENE)、凝膠成像儀(GAS740Ⅸ)、超凈工作臺(tái)BCM-1300A型(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、滅菌器(日本HIRAYAMA)等。

試劑：CTAB緩沖液、10×TAE緩沖液、TaqDNA聚合酶、DNTP、10×TaqBuffer、D2000 DNA Ladder、X-gal(200 g·L-1)、IPTG(500 mmol·L-1)、胰蛋白胨、瓊脂糖均購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司，其他：液氮、β-疏基乙醇(>98%)、氯仿-異戊醇(V氯仿︰V異戊醇=24︰1)等。

1.4 地衣內(nèi)生真菌檢測(cè)

1.4.1 DNA提取利用改良CTAB方法提取地衣內(nèi)生真菌的DNA，從超低溫水箱取約0.1 g地衣樣品，迅速在經(jīng)預(yù)冷的研缽中加入適量液氮進(jìn)行研磨，研磨成粉狀后加1 mL 2×CTAB提取液，經(jīng)水浴、抽提、漂洗等環(huán)節(jié)得到DNA樣品。具體步驟見文獻(xiàn)[23]。

1.4.2 ITS擴(kuò)增采用PCR法擴(kuò)增真菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，擴(kuò)增引物為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。每25 μL PCR反應(yīng)體系分別含有1 μL模板DNA，0.5 μL(2.5 mmol·L-1)dNTPs，2.5 μL 10×PCR緩沖液(Takara，Otsu，Japan)，ITS1F與ITS4引物各0.5 μL(10 μmol·L-1)，0.5 μLTaqDNA聚合酶(Takara，Otsu，Japan)，2 μL BSA溶液。PCR反應(yīng)程序： 94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 55 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將ITS-PCR產(chǎn)物在w=1 %的瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像儀觀察、拍照。

1.4.3 PCR產(chǎn)物克隆及測(cè)序根據(jù)電泳結(jié)果選取條帶單一、明亮清晰的PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收，割膠回收試劑盒選取TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA extraction Kit Ver.4.0，將回收的PCR產(chǎn)物作為外源DNA，克隆到pMD19-T Vector (Takara，Otsu，Japan)，在16 ℃下連接1過夜，用E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(Takara，Otsu，Japan)轉(zhuǎn)化。利用藍(lán)白斑法，篩選出生長良好的陽性克隆，用引物ITS1F和ITS4擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物在w=1 %的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。電泳檢測(cè)呈陽性的PCR產(chǎn)物委托北京諾賽基因進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析對(duì)測(cè)序公司返回的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理和修正，用BioEdit建立本地?cái)?shù)據(jù)庫，把比對(duì)結(jié)果的相似性≥97%的序列視為同一物種，劃分OTU(operational taxonomic unit, OTU)。把劃分好的序列在NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行檢索，選出地衣型真菌和與其同源性較高的參考序列，通過MEGA6.06共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣內(nèi)生真菌的種類組成與發(fā)育樹檢測(cè)結(jié)果可以劃分為31個(gè)OTUs(以后統(tǒng)稱為物種)，又可以劃分擔(dān)子菌門和子囊菌門2個(gè)大類，其中，8種隸屬于擔(dān)子菌門(圖2)，23種隸屬于子囊菌門(圖3)。

圖2 擔(dān)子菌門內(nèi)生真菌進(jìn)化樹

圖3 子囊菌門內(nèi)生真菌進(jìn)化樹

2.2 地衣型真菌群落物種的水平空間分布擔(dān)子菌門地衣內(nèi)生菌的地衣宿主有9種，分別為鴨腳木、方枝蒲桃、異株木犀欖、白茶、海南大風(fēng)子、子凌蒲桃、粗毛野桐、輪葉木姜子和糙果油茶，分布的樣地有12個(gè)(圖4)，分別為P00-1，P04-14，P11-2，P22-3，P25-12，P33-4，P52-17，P55-6，P61-18，P66-7，P74-20和P77-8。

子囊菌門地衣內(nèi)生菌的地衣宿主有14種，分別為：鴨腳木、方枝蒲桃、異株木犀欖、瓊刺欖、白茶、濱木患、海南大風(fēng)子、赤楠蒲桃、粗毛野桐、假蘋婆、黃椿木姜、拱脈核果木、肖蒲桃和毛茶。分布的樣地有18個(gè)(圖4)，分別為P00-1，P07-10，P11-2，P16-11，P22-3，P25-12，P33-4，P34-13，P47-9，P40-15，P43-16，P44-5，P55-6，P61-18，P66-7，P70-19，P74-20和P77-8。

本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)到26種地衣型真菌，每種地衣在樣地內(nèi)的分布狀況如表2所示。

表2 20個(gè)樣方中檢測(cè)到的26種地衣型真菌的分布狀況

注：樣地從右上角起，從上至下從左到右分別指代為1～20號(hào)，如1號(hào)代表P00-1，2號(hào)代表P4-14，4號(hào)代表P11-2。依此類推，“1”代表地衣在樣地內(nèi)有分布，“0”代表無分布

Note: Quadrats from top to bottom and from left to right at the right corner refer to No. 1-20. For example, No. 1 refers to P00-1, No. 2 refers to P4-14, No. 4 refers to P11-2. The rest can be deduced as such.“1” means that lichens are distributed in the quadrats, and “0” means no distribution

由圖4所示，樣地色塊顏色越深，說明地衣越豐富，樹干地衣在樣地的分布基本均勻且廣泛。由表2可知，大多數(shù)樣方普遍出現(xiàn)6～12種，19號(hào)樣方中僅出現(xiàn)了1種，7號(hào)樣方中出現(xiàn)了18種。較為普遍的情況是每種地衣可以在4～7個(gè)樣方中找到，OTU1出現(xiàn)最頻繁，在15個(gè)樣方中出現(xiàn)。總體來看，地衣型真菌在銅鼓嶺大型樣地的分布在空間中是隨機(jī)的、沒有明顯的規(guī)律，或者說它們的群落組成并不集中。

2.3 地衣內(nèi)生真菌群落物種組成與宿主的關(guān)系從表1和表3中可知，在銅鼓嶺重要值前20的樹種中，只有17種有地衣附生，在重要值大小排序?yàn)榈?的貢甲、第8的假赤楠蒲桃和第15的九節(jié)的樹干(0～2.0 m)上未采集到地衣。海南大風(fēng)子(重要值第9、相對(duì)密度第5、相對(duì)頻度第6、相對(duì)顯著度第14、個(gè)體數(shù)第5，下同)的樹干地衣豐富度最大，白茶(6，3，3，13，3)次之，方枝蒲桃(2，1，1，5，1)排第3，肖蒲桃(18，19，20，9，18)排第4，而瓊刺欖(5，4，2，13，4)，輪葉木姜子(13，8，9，20，8)，赤楠蒲桃(10，13，12，6，13)，子凌蒲桃(11，17，14，7，12)的樹干地衣豐富度最小，分別都僅出現(xiàn)1種。因此，初步認(rèn)為樹干地衣豐富度與宿主在群落中的重要值、相對(duì)密度、相對(duì)頻度、相對(duì)顯著度及個(gè)體數(shù)關(guān)系不大，而可能是與宿主本身形成較復(fù)雜的關(guān)系，有待深入研究。

綜合分析表3和表4可知，子囊菌門的地衣內(nèi)生真菌分布較多且宿主較廣泛，分布范圍沒有明顯的規(guī)律，有8種是廣泛分布的，13種是專一分布的；擔(dān)子菌門的地衣內(nèi)生真菌分布較少且宿主較少，分布范圍沒有明顯的規(guī)律，其中，有2種僅從鴨腳木樹干上的地衣分離出來，1種僅從糙果油茶樹干上的地衣分離出來，1種僅從方枝蒲桃樹干上的地衣分離出來。因此，無論是子囊菌門的樹干地衣還是擔(dān)子菌門的樹干地衣都可能具有專一分布性，對(duì)宿主的喜好或許與宿主的樹皮綜合性質(zhì)有關(guān)，還有待進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表3 20種宿主中檢測(cè)到的地衣內(nèi)生真菌的的分布狀況

表4 宿主中檢測(cè)到的地衣內(nèi)生真菌的物種組成及分布狀況

3 討 論

3.1 海南熱帶濱海森林地衣內(nèi)生真菌的種類組成與豐富度在銅鼓嶺地衣調(diào)查的記載中，只有根據(jù)形態(tài)學(xué)辨別判斷為象形霜盤衣(Diorygmahieroglyphicum)[27-29]的相關(guān)記錄，本次調(diào)查豐富了銅鼓嶺保護(hù)區(qū)樹干地衣的記錄。

森林類型、環(huán)境條件不同，造成森林樹干地衣的物種組成與豐富度的差異，如在澳大利亞塔斯馬尼亞島西部的雨林中，從1株伐倒的淚柏(Lagarostrobosfranklinii)上就采集到多達(dá)76種的地衣[25]；泰國北部調(diào)查到的樹干地衣在山地栲類林中有107種、季節(jié)性常綠林中有86種、干旱龍腦香林中有62種[26]，鐵軍等[5]在神農(nóng)架千家坪落葉闊葉林和針葉混交林調(diào)查到52種地衣，均高于銅鼓嶺自然保護(hù)區(qū)固定樣地所調(diào)查的樹干地衣豐富度。HAUCK等[30]在德國哈爾茨山50株挪威云杉(Piceaabies)樹干處收集到21種地衣，略低于銅鼓嶺。李蘇等[24]對(duì)云南哀牢山地區(qū)的亞熱帶山地濕性常綠闊葉林開展的相關(guān)研究中，找到5種樹干地衣，低于銅鼓嶺。銅鼓嶺地衣的種類組成與豐富度可能與其獨(dú)特地理位置、氣候環(huán)境等因素有關(guān)，也與研究方法、技術(shù)水平、實(shí)驗(yàn)條件等因素有關(guān)，仍需進(jìn)一步探索。

3.2 海南熱帶濱海森林地衣的種類的分布特點(diǎn)

3.2.1 熱帶森林中樹干地衣分布與宿主在群落中的地位的關(guān)系本研究結(jié)果表明，樹干地衣最多的是海南大風(fēng)子，最少的是子凌蒲桃等4個(gè)種，地衣的分布與宿主在群落中的重要值、個(gè)體數(shù)、相對(duì)密度、相對(duì)頻度及相對(duì)顯著度關(guān)系不大，即與其宿主在群落中的地位關(guān)系不大。

有研究發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)勢(shì)種相對(duì)單一的受溫帶大陸性季風(fēng)氣候影響的溫帶森林中，地衣的分布與優(yōu)勢(shì)種沒有必然聯(lián)系。陳健斌等[11]在對(duì)北京東靈山小龍門地區(qū)樹干地衣的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，以華北落葉松(Larixprincipisrupprechtii)為優(yōu)勢(shì)種的落葉松林中華北落葉松樹干上未見到樹干地衣，人工油松林中油松(Pinustabuliformis)上地衣覆蓋度在10%以下；在優(yōu)勢(shì)種相對(duì)于熱帶森林較顯著的亞熱帶森林中，樹干地衣主要集中分布在優(yōu)勢(shì)度較大的幾種樹木上，如LOPPI等[31]在意大利中部森林研究群落中3種優(yōu)勢(shì)樹種苦櫟(Quercuscerris)、冬青櫟(Quercus.ilex)、歐洲水青岡(Fagussylvatica)樹干地衣數(shù)量最多，神農(nóng)架地區(qū)的次生針闊混交林樹干地衣及分布的研究中，10種優(yōu)勢(shì)樹種均有地衣附生[13]。從樹干地衣和其附生的樹木種類來看，地衣的分布與宿主本身有一定的關(guān)系，在亞熱帶森林中，優(yōu)勢(shì)樹種相對(duì)熱帶森林較顯著，優(yōu)勢(shì)樹種種類相對(duì)較少，個(gè)體數(shù)量相對(duì)較多，其他樹種多呈零星分布，樹干地衣自然分布在少數(shù)幾種優(yōu)勢(shì)樹種樹干上；然而在熱帶地區(qū)多優(yōu)群落的森林中，優(yōu)勢(shì)物種多且彼此之間差距極小，樹干地衣的分布與宿主在群落中的地位無明顯關(guān)系。筆者發(fā)現(xiàn)，地衣的附生和分布情況與其對(duì)宿主本身的偏好有關(guān)，例如宿主樹皮的理化性質(zhì)，元素含量，宿主的樹齡等，這還有待于進(jìn)一步的探索。

3.2.2 樹干地衣在宿主樹干上的分部高度李蘇等[24]在云南哀牢山地區(qū)的熱帶季雨林原生林中獲得附生于0～2.0 m的樹干地衣5種。楊林等[13]對(duì)神農(nóng)架地區(qū)的次生針闊混交林樹干1.3 m處共獲得樹干地衣51種。LOPPI S等[31]在意大利中部森林的3種優(yōu)勢(shì)樹種苦櫟、冬青櫟、歐洲水青岡的樹干(1.2～1.7 m處)，分別發(fā)現(xiàn)了36，18，20種樹干地衣。本研究結(jié)果表明，銅鼓嶺樹干地衣優(yōu)先分布在0.6～1.4 m的樹干上，且物種數(shù)量相對(duì)于其他地區(qū)較少。同時(shí)，樹干上還有其他附生生物，地衣的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)和生態(tài)位可能是決定地衣優(yōu)先分布高度的重要原因[32]。

3.2.3 銅鼓嶺樹干地衣海拔分布規(guī)律當(dāng)前的樹干地衣研究多針對(duì)海拔高度進(jìn)行比較[6，9-11]，如艾尼瓦爾[9]發(fā)現(xiàn)，地衣的分布規(guī)律成曲線分布，在800～1 100 m發(fā)生量穩(wěn)定，在海拔1 100～1 850 m范圍內(nèi)逐漸增多，于1 650～1 800 m達(dá)到最高，然后又隨著海拔升高地衣發(fā)生量逐漸下降；艾尼瓦爾在對(duì)阿勒泰東部山區(qū)的調(diào)查中，也得到相似結(jié)論[6]；姜山[10]在貴州的地衣調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，高海拔的分布多于低海拔；但是，在北京東靈山地衣的發(fā)生量卻隨海拔的升高而顯著增加[11]。

目前，地衣水平分布規(guī)律的研究相對(duì)較少。銅鼓嶺固定樣地的地勢(shì)有利于探索樹干地衣的水平分布特點(diǎn)。本研究結(jié)果說明，樹干地衣的分布格局隨其偏好的宿主的分布而分布，在本研究設(shè)計(jì)選擇的樣方內(nèi)，地衣宿主多呈隨機(jī)分布，因此，地衣在森林群落中的水平分布是隨機(jī)的。RUSSELL[33]測(cè)定了不同海拔森林內(nèi)濕度的日變化，認(rèn)為影響樹干地衣垂直分布規(guī)律的重要因素是空氣相對(duì)濕度，銅鼓嶺樹干地衣分布隨機(jī)無明顯規(guī)律的原因可能與空氣相對(duì)濕度有關(guān)，仍需進(jìn)一步研究。

本次調(diào)查豐富了銅鼓嶺的樹干地衣記錄，樹干地衣由歷史記錄中的1種豐富至26種，遺憾的是，由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，采樣過程中地衣物種的遺漏、鑒定過程中的困難以及銅鼓嶺地區(qū)地衣名錄的缺乏，還需進(jìn)一步的研究才能全面地了解銅鼓嶺樹干地衣的分布與組成；銅鼓嶺熱帶濱海森林大型樣地內(nèi)，地衣在同一個(gè)海拔高度水平里，呈隨機(jī)分布的狀態(tài)；當(dāng)樹干地衣取樣高度在2.0 m以下時(shí)，樹干地衣主要分布高度為0.6～1.4 m，由于條件所限，筆者無法調(diào)查林冠層附生地衣的分布和組成，今后還有待進(jìn)一步研究樹干地衣在單株樹木上的分布規(guī)律。本調(diào)查結(jié)果表明，在熱帶多優(yōu)群落的森林中，樹干地衣豐富度及其分布與宿主在群落中的生態(tài)地位無關(guān)，這一點(diǎn)需要在熱帶地區(qū)更多不同的森林類型和環(huán)境中進(jìn)一步研究證實(shí)。