拮抗草莓灰霉病菌的內(nèi)生細(xì)菌SL2的分離及鑒定

李 娜

摘要從草莓健康葉片中分離到27株內(nèi)生細(xì)菌,與草莓灰霉病菌的對(duì)峙試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明,其中有3株對(duì)草莓灰霉病菌具有顯著拮抗作用。且SL2的抑菌效果最為明顯,其抑菌半徑達(dá)到14mm,通過對(duì)其進(jìn)行形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列等方面的研究,初步鑒定SL2為地衣芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞內(nèi)生細(xì)菌;草莓灰霉病菌;地衣芽孢桿菌;16S rDNA

中圖分類號(hào) Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)21-0296-01

內(nèi)生菌存在于健康植株中,能夠通過占據(jù)有利的生態(tài)位點(diǎn)來防止病原菌的入侵[1],并兼具克服附生細(xì)菌定植能力差、防效不穩(wěn)定等特點(diǎn),因此具有拮抗作用的內(nèi)生菌是生物防治的潛在資源[2]。草莓灰霉病發(fā)生在草莓的開花后期和采收期,嚴(yán)重危害到其產(chǎn)量和質(zhì)量[3],雖然使用化學(xué)農(nóng)藥能夠減輕這種危害,但其造成的環(huán)境污染及果實(shí)中農(nóng)藥殘留超標(biāo)等副作用也日益引起人們的關(guān)注。因此,分離篩選有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)防治草莓灰霉病有極其重要的意義。

1材料與方法

1.1供試材料

供試病原菌為草莓灰霉病菌。內(nèi)生細(xì)菌分離,從草莓基地采集草莓葉片,經(jīng)嚴(yán)格的表面消毒,組織勻漿后稀釋涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上,37℃培養(yǎng)3～5d。挑取大小、顏色、形態(tài)不同的菌落,純化得單菌落。

1.2拮抗菌的篩選

采用對(duì)峙培養(yǎng)法,取直徑為8mm的病原菌餅置于PDA平板(Φ90mm)中央,用接種環(huán)挑取純化好的菌種點(diǎn)接在距平板中央3cm處的4個(gè)角點(diǎn)上,25℃培養(yǎng)7d后測(cè)量抑菌帶寬。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。選出對(duì)病原菌生長(zhǎng)有抑制作用,且被抑病原菌絲邊緣平齊、拮抗作用持久的菌株。

1.3拮抗菌的形態(tài)及生理生化鑒定

拮抗細(xì)菌的形態(tài)、培養(yǎng)性狀和生理生化特性測(cè)定參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)鑒定》[4,5]。

1.416S rDNA 的PCR擴(kuò)增和序列分析

抽提拮抗菌總DNA,利用16S rDNA 細(xì)菌通用引物16SR1 (AGAAAGGAGGTGATCCAGCC);16SF1(AGAGTT TGA-TCC TGGCTCAG)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物回收,送至上海生工生物科技公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Blast軟件在GenBank中進(jìn)行同源性比較。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生菌拮抗活性

從草莓葉片中共分得27株細(xì)菌,其中3株有拮抗活性,SL2有明顯的抑菌帶(見圖1)。抑菌半徑達(dá)14mm。

2.2拮抗內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)特征和生理生化特性

SL2菌株形態(tài)特征:淺黃色、不規(guī)則、邊緣皺縮、不透明;革蘭氏染色呈陽性、桿菌i;有芽孢。SL2菌株生理生化特性見表1。

2.3菌株SL2的16S rDNA序列分析

菌株SL2的16S rDNA PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 100bp,用ClustalX程序?qū)闟L2的16S rDNA序列和GenBank中已登錄的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),SL2與acillus licheniformis strain CICC 10181(GQ375235)序列相似度達(dá)99%,結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果,可初步鑒定菌株SL2為地衣芽孢桿菌。

3結(jié)論與討論

據(jù)報(bào)道,從植物體內(nèi)分離篩選到的內(nèi)生細(xì)菌多具有防病、促生等作用,可用于生防制劑的開發(fā)應(yīng)用[2,6]。試驗(yàn)從草莓葉片中分離具有較高拮抗作用的地衣芽孢桿菌SL2,具有生防菌株的潛力,但對(duì)其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究,以期能為生物防治獲得較好的活性物質(zhì)。

4參考文獻(xiàn)

[1] HALLMANN J,QUADT-HALLMANN W F,MAHAFFEE A,et al. Bacterial endophytes in the agricultural crops[J].Can J Microbiol,1997,(43):895-914.

[2] 何紅,蔡學(xué)清,洪永聰,等.辣椒內(nèi)生細(xì)菌的分離及拮抗菌的篩選[J].中國(guó)生物防治,2002,18(4):171-175.

[3] FARVIS W R. The Biology of Botrytis[M].Academic Press,1980.

[4] BUCHANAN RE,GIBBONS N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)[M].北京:科學(xué)出版社,1984.

[5] 東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

[6] 袁軍,孫福在,田宏先,等.防治馬鈴薯環(huán)腐病有益內(nèi)生細(xì)菌的分離和篩選[J].微生物學(xué)報(bào),2002,42(3):270-274.