同種異體大鼠肝移植在不同免疫狀態(tài)下的實驗研究

程　凱　楊振林　耿永志　鄒偉偉

【摘要】目的：觀察不同免疫狀態(tài)下大鼠同種異體移植肝早期的病理變化和受體生存狀況的改變。方法：分三組：A組：n=36，同基因移植組（BN→BN）；B組：n=36，異基因移植+環(huán)孢素A（CsA）組；C組：n=36，異基因移植組（Lewis→BN），另外各設(shè)亞組觀察生存期。于移植后1、3、5、7、14天檢測移植肝排斥反應(yīng)病理分級，并觀察移植鼠存活時間。結(jié)果：①A組；同基因移植肝無明顯病理急性排斥反應(yīng)發(fā)生；除第1天外，B組和C組各時間段的排斥分級明顯高于A組（P<0.05或<0.01）；而C組和B組相比亦有明顯增高（P<0.05或<0.01）。②A組和B組的生存期平均大于100天，明顯長于C組(34.3(3.56天)。結(jié)論：①同基因大鼠肝移植不發(fā)生明顯的病理急性排斥反應(yīng)，術(shù)后生存狀況良好。②短期應(yīng)用小劑量環(huán)孢素A（CsA）能明顯抑制異基因同種大鼠移植肝的病理急性排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受的發(fā)生。③異基因大鼠移植肝早期出現(xiàn)明顯的病理急性排斥反應(yīng)，術(shù)后生存狀況差，生存期較短。

【關(guān)鍵詞】肝移植；排斥反應(yīng)；免疫耐受；環(huán)孢素A

【中圖分類號】R617【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1007-8517(2009)08-0028-02

臨床器官移植的長期存活率得到明顯提高，已成為終末期器官功能衰竭病人的最佳治療方案。然而，同種異體排斥反應(yīng)仍然是器官移植的主要障礙。大鼠肝移植是目前最常用的肝移植動物試驗?zāi)Ｐ?，為臨床提供了大量寶貴的試驗數(shù)據(jù)，下面是我們利用近交系Lewis和BN大鼠進(jìn)行肝移植的一組試驗數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗動物

1.1.1供鼠近交系Lewis大鼠，雄性，SPF/VAF，體重200～250g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2受鼠近交系BN大鼠，雄性，SPF/VAF，體重200-250g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。我們采用改進(jìn)的Kamada等袖套方法建立肝移植模型。動物均在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)。

1.1.3實驗為同種異體移植另外各設(shè)亞組觀察生存期。移植后1、3、5、7、14天切取移植肝臟用于病理學(xué)的檢測。另外設(shè)亞組觀察移植后一般情況和肝移植術(shù)后受體的存活時間。

1.2實驗動物分組、標(biāo)本采集

1.2.1實驗動物分組實驗為同種異體移植，分為三個組，另外每組設(shè)亞組6只肝移殖大鼠觀察移植后一般情況和肝移植術(shù)后受體的存活時間。①A組：n=36，同基因移植組（BN→BN）；②B組：n=36，異基因移植（Lewis→BN）+環(huán)孢素A（CsA）組；大鼠肝移植后用環(huán)孢霉素A（CsA）2.0mg/kg/d皮下注射0-7天；③C組：n=36，異基因移植組（Lewis→BN），

1.2.2標(biāo)本采集在移植后1、3、5、7、14天時間段各殺死6只大鼠。取肝組織放入10%中性甲醛固定，制成蠟塊并切片，用于排斥反應(yīng)病理學(xué)檢查。各個亞組在標(biāo)準(zhǔn)條件下喂養(yǎng)，觀察移植鼠的一般生活狀態(tài)和并記錄其存活時間。參照Kemnitze的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行急性排斥反應(yīng)分級:0級無排斥證據(jù)；0-1級有排斥傾向，但不足于診斷：輕度的匯管區(qū)混合性細(xì)胞浸潤，膽管損傷，無靜脈內(nèi)皮炎；1級輕度急性排斥：匯管區(qū)輕度單個核細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，部分可見混合性細(xì)胞。匯管區(qū)或/和中央靜脈區(qū)可見靜脈內(nèi)皮炎；肝實質(zhì)細(xì)胞壞死可以見到，10%以上的肝實質(zhì)區(qū)域可見單個核細(xì)胞浸潤，膽管損傷；2級中度急性排斥：匯管區(qū)可見更明確的單個核細(xì)胞浸潤，肝實質(zhì)細(xì)胞退行性改變。部分區(qū)域可見非橋接性壞死，肝實質(zhì)區(qū)域可見混合性細(xì)胞浸潤，以單個核細(xì)胞為主，約占整個肝實質(zhì)區(qū)的10-30%，匯管區(qū)和中央靜脈內(nèi)皮炎，膽管損傷；3級重度急性排斥：匯管區(qū)和肝實質(zhì)區(qū)可見明顯的混合性細(xì)胞浸潤，以單個核細(xì)胞為主，30%以上的整個肝實質(zhì)區(qū)有明確的退行性變和壞死，部分為橋接壞死，匯管區(qū)和中央?yún)^(qū)靜脈內(nèi)皮炎，膽管損傷。

1.2.3統(tǒng)計學(xué)處理實驗所得數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計學(xué)處理用spss11.0軟件完成。各組肝移殖受體存活率評估以Kaplan-Meier法檢驗，其它參數(shù)作One-way ANOVA分析及q檢驗，P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1各組大鼠術(shù)后一般狀態(tài)及生存時間。見圖1。A組及B組分別和C組比較，P<0.001。

全部受者均于術(shù)后0.5-1小時內(nèi)蘇醒，一般1-3小時后可進(jìn)水、一天后進(jìn)食。A組，七天后皮毛正常，體重增加，均長期存活，（大于100天）。C組大鼠皮毛灰暗，進(jìn)食差，體重進(jìn)行性減輕，術(shù)后28-38天全部死亡，中位存活時間33.3天。 B組大鼠，6只中4只獲得長期存活，用藥期間一般狀態(tài)差，進(jìn)食少，體重不增加，但停藥后好轉(zhuǎn)，精神狀態(tài)逐日好轉(zhuǎn)，活動增加，生存時間明顯延長，平均生存時間大于100天；A組和B組分別與C組比較，P<0.001。B組和A組比較差異沒有顯著性意義。

2.2移植肝病理表現(xiàn)及排斥分級見圖2。

A組供肝各個時間段病理學(xué)檢查(附圖3-1)，部分匯管區(qū)有少量炎性細(xì)胞浸潤，術(shù)后第3天和第5天分級為0.18和0.19級，其他時間段均為0。B組(附圖3-2)第1天未見有排斥表現(xiàn)，第3天可見淋巴細(xì)胞浸潤，平均排斥分級分別為0.48,第5、7天淋巴細(xì)胞細(xì)胞浸潤更加明顯，平均排斥分級分別為0.67和1.10,14天淋巴細(xì)胞浸潤，膽管增生存在，平均排斥分級1.16。C組(附圖3-3)供肝術(shù)后第1天匯管區(qū)有少量炎性細(xì)胞浸潤，可見門靜脈和中央靜脈內(nèi)皮腫脹，未見排斥發(fā)生，術(shù)后第3天匯管區(qū)淋巴細(xì)胞細(xì)胞浸潤明顯，可見肝實質(zhì)變性，平均排斥分級1.59級，術(shù)后第5天中度排斥表現(xiàn)，平均排斥分級為2.34級術(shù)后第7天和14天，出現(xiàn)嚴(yán)重急性排斥表現(xiàn)，靜脈內(nèi)皮炎明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤，可見肝的變性壞死，膽管內(nèi)皮炎或小小膽管消失，平均排斥分級分別為2.87和2.93；除第1天外，B組各時間段的排斥分級明顯高于A組，差別顯著（P<0.05或<0.01）,而C組排斥分級升高更加明顯，分別和B組及A組相比有顯著性差別，（P<0.05或<0.01）。

3討論

本實驗研究表明同基因大鼠肝移植，移植肝不發(fā)生急性排斥反應(yīng)，受鼠術(shù)后生存狀況良好。此實驗結(jié)果再一次為臨床移植提供理論依據(jù)，同卵雙生個體之間進(jìn)行器官移植不會發(fā)生排斥反應(yīng)，是最理想的供受體結(jié)合。但是這樣的移植機(jī)會很少，所以盡量選擇基因配型相近的供受體是臨床移植努力爭取的。同種異體之間進(jìn)行器官移植是臨床最常見的，由于非同基因之間進(jìn)行移植，急性排斥反應(yīng)是不可回避的難題，C組的實驗結(jié)果進(jìn)一步證明了急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，會造成受體內(nèi)移植物結(jié)構(gòu)的破壞，生活質(zhì)量的下降和生命的短期喪失。所以，抑制急性排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)機(jī)體抗原特異性免疫耐受，是解決器官移植排斥的根本方法。我國肝移植發(fā)展迅猛，大鼠肝移植模型將為肝移植的基礎(chǔ)和臨床研究提供重要的實驗手段。Lewis-BN大鼠肝移植是國際上通用的、用來研究急性排斥反應(yīng)的動物模型。在本試驗中，C組，第3天排斥分級較A組明顯升高，兩者比較P<0.05,在第5天排斥分級進(jìn)一步升高，第7、14天達(dá)到高峰，和A組相比較P<0.001，組內(nèi)比較P<0.01,是一個比較理想的急性排斥模型。

短期應(yīng)用小劑量CsA能使排斥的大鼠肝移植導(dǎo)致耐受或者長期接受。CsA使多種移植模型達(dá)到長期接受或耐受的機(jī)理與其參與了多方面的免疫作用有關(guān)。CsA抑制已接觸抗原的CTL產(chǎn)生，其受體為環(huán)孢素結(jié)合蛋白(cyclophilin)；在基因水平，CsA抑制IL-2和IFN-γ生成與釋放，IL-2是T細(xì)胞存活、分化、增殖的生長因子，IFN-γ是促進(jìn)Th1細(xì)胞分化的關(guān)鍵性因子；Khanna等報道，CsA能刺激轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)基因啟動子的活性，從而使TGF-β表達(dá)增高；據(jù)報道，在體內(nèi)或體外給予CsA，以NF-κB為目標(biāo)靶，可抑制NF-κB核移位，從而抑制樹突狀細(xì)胞(DC)的成熟。成熟的DC則在同種移植物排斥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用；未成熟的DC則能延長移植器官存活。本研究應(yīng)用近交系大鼠Lewis作為供體，BN大鼠作為受體實行原位肝移植，從0～7天給予CsA 2mg/kg/d,結(jié)果證明CsA能使受體BN的平均生存期明顯延長，多數(shù)大于100天，而沒有應(yīng)用CsA的C組的平均生存期僅為33天，兩組的生存率比較有明顯的差別，P<0.001；和A組相比兩組的生存率沒有明顯的差別，證明在短期小劑量應(yīng)用CsA的情況下，此肝移植模型是用來研究移植肝臟長期被接受或者免疫耐受的比較理想的模型。

參考文獻(xiàn)

[1]Kamada N, Calne RY. A surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat[J]. Surgery,1983,Jan;93(1 Pt 1):64-69.

[2]楊振林,鄭樹森,沈克震,等.大鼠肝移植術(shù)中供肝再灌注不良的原因分析及預(yù)防措施[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報,2006,19:221-224.

(收稿日期：2009.02.10)