聚焦生物工程中的“篩選”問題

袁錦明

近年來(lái)，關(guān)于生物工程中的“篩選”問題在各地的高考試題和模擬試題中多次涉及，它不僅考查了學(xué)生的分析推理能力、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力，還能考查學(xué)生獲取信息應(yīng)用知識(shí)的能力。下面，筆者就生物工程中的“篩選”問題作一具體分析。

1、基因工程中重組DNA分子的篩選

基因工程的第一步是提取目的基因，第二步是將目的基因與運(yùn)載體結(jié)合，即把用同一種限制性核酸內(nèi)切酶處理的目的基因與運(yùn)載體混合，再加入DNA連接酶，使DNA片段相同的黏性末端能夠連接起來(lái)，因?yàn)檫@些DNA有相同的黏性末端，所以在DNA連接酶的作用下，必然形成一個(gè)封閉式的環(huán)狀的DNA。這些環(huán)狀的DNA有的是由一個(gè)DNA片段形成的，共有兩種，即目的基因環(huán)狀物和運(yùn)載體環(huán)狀物；有的是由兩個(gè)DNA片段形成的，共有三種，即目的基因—載體連接物、載體—載體連接物 、目的基因—目的基因連接物。若要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質(zhì)粒，需要對(duì)這些連接產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。常用的方法有抗藥性標(biāo)記選擇法（插入失活法），即將目的基因插入帶amp^R和tct^R基因載體的tct^R基因（或amp^R基因）中，則tct^R基因（或amp^R基因）失活，再在分別含有氨芐青霉素和含四環(huán)素的兩個(gè)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行篩選。

[例1]：(2008海南高考題) 右圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡(jiǎn)圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI的酶切位點(diǎn)，amp^R為青霉素抗性基因，tct^R為四環(huán)素抗性基因，P為啟動(dòng)因子，T為終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。

（1）將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒表達(dá)載體分別用EcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進(jìn)行連接后，其中由兩個(gè)DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有__________、__________、__________三種。若要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質(zhì)粒，需要對(duì)這些連接產(chǎn)物進(jìn)行__________。

（2）用上述3種連接產(chǎn)物與無(wú)任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞接種到含四環(huán)的培養(yǎng)基中，能生長(zhǎng)的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物是____________________。

（3）目的基因表達(dá)時(shí)，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)是 ，其合成的產(chǎn)物是______________________________。

（4）在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時(shí)應(yīng)選用的酶時(shí) 。

[解析]：考查基因工程重組DNA的構(gòu)建與篩選，以及基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)調(diào)控。

(1)考慮載體的自連接、目的基因的自連接及載體和目的基因的相互連接。

(2)載體—載體連接物含有amp^R(青霉素抗性基因)和tct^R(四環(huán)素抗性基因)，其宿主細(xì)胞接種到含四環(huán)素、青霉素的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)。由于目的基因插入tct^R四環(huán)素抗性基因位置，使得該四環(huán)素抗性基因完整性破壞而不能表達(dá)，但因含有tct^R(四環(huán)素抗性基因)，所以將相應(yīng)宿主細(xì)胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，接種到含青霉素的培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)。

(3)目的基因表達(dá)時(shí),RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)是啟動(dòng)子，作為轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)，其合成產(chǎn)物是mRNA。

(4)質(zhì)粒包括EcoRI、BamHI酶切位點(diǎn)，目的基因的兩端分別有EcoRI、BamHI酶切位點(diǎn),若用該兩種酶同時(shí)處理質(zhì)粒、目的基因會(huì)得到相同黏性末端，其目的基因——載體連接物就只能有一種。當(dāng)然還有若干載體——載體連接物、目的基因-目的基因連接物。

[答案]：

（1）目的基因—載體連接物 載體—載體連接物 目的基因—目的基因連接物 分離純化 （2）載體-—載體連接物；目的基因-—載體連接物、載體—載體連接物 （3）啟動(dòng)子 mRNA （4）EcoRI和BamHI

[例2]：科學(xué)家利用基因工程成功地將人的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌體內(nèi)生產(chǎn)出人的胰島素。在該過(guò)程中采用質(zhì)粒作為運(yùn)載體，已知質(zhì)粒上含有抗氨芐青霉素（簡(jiǎn)稱氨芐）和抗四環(huán)素的基因（位于不同區(qū)段），目的基因與質(zhì)粒的結(jié)合位點(diǎn)剛好位于抗氨芐青霉素基因結(jié)構(gòu)內(nèi)，且受體大腸桿菌體內(nèi)不含質(zhì)粒，也不含質(zhì)粒上的抗藥基因。導(dǎo)入完成后，在得到的大腸桿菌中，實(shí)際上有的根本沒有導(dǎo)入質(zhì)粒，有的導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒，只有少數(shù)導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒。某科研機(jī)構(gòu)想從培養(yǎng)基上篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌（即“目的菌種”），他們?cè)O(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn)方案：

第一步：將得到的大腸桿菌接種在含的培養(yǎng)基上，篩選出含有質(zhì)粒的大腸桿菌。

第二步：為選出“目的菌種”，將第一步篩選出的大腸桿菌中選用“印影法”分離。

①采用涂布平板法，將第一步篩選的大腸桿菌以合適的稀釋度涂布_______________________上，經(jīng)培養(yǎng)后形成單菌落，如圖1B所示。

②通過(guò)一消毒的“印章”（如圖1A所示），將培養(yǎng)基上的菌落分別按原位印跡到圖1所示的非選擇培養(yǎng)基__________和選擇培養(yǎng)基__________上（順序不能顛倒，C培養(yǎng)基成分與B相同，D上含有氨芐青霉素，含重組質(zhì)粒的大腸桿菌不能生長(zhǎng)）。

③培養(yǎng)后對(duì)照觀察C、D培養(yǎng)基上的單菌落。

④在C培養(yǎng)基上挑取D培養(yǎng)基上不生菌落的位置上的單菌落，從而獲得含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，即“目的菌種”。

⑤實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用過(guò)的培養(yǎng)基應(yīng)該進(jìn)行滅菌處理后才能倒掉，這樣做的的目的是____________________

[答案]：四環(huán)素 到含普通質(zhì)粒的大腸桿菌和含重組質(zhì)粒的大腸桿菌都能生長(zhǎng)的培養(yǎng)基 C D防止污染環(huán)境

2、細(xì)胞工程中雜種細(xì)胞的篩選

2.1植物體細(xì)胞雜交中融合體的類型和雜種細(xì)胞的篩選

植物體細(xì)胞雜交中融合體的類型有以下三種：①未融合細(xì)胞：再生植株與親本相同；②自體融合：融合結(jié)果得到“同核體”； ③異體融合：融合結(jié)果得到“異核體”。例如，在一定的技術(shù)手段（物理法、化學(xué)法）協(xié)助下進(jìn)行植物A、B細(xì)胞的人工誘導(dǎo)融合，先進(jìn)行膜的融合，再進(jìn)行核的融合，最后形成雜種細(xì)胞，雜種細(xì)胞有三種：AA型、BB型、AB型，只有AB型才是我們所需要的雜種細(xì)胞，所以需要進(jìn)行篩選，再通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)，培育成雜種植株。雜種細(xì)胞的篩選方法有以下幾種：①利用雙親細(xì)胞形態(tài)和色澤上的差異識(shí)別雜種細(xì)胞，這是最簡(jiǎn)單的選擇方法。②遺傳互補(bǔ)篩選法：利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常的等位基因，糾正另一親本的缺陷，從而使雜種細(xì)胞表現(xiàn)出正常功能的原理選擇雜種細(xì)胞；③抗性互補(bǔ)篩選法：利用親本原生質(zhì)體對(duì)抗生素、除草劑及其他毒性物質(zhì)抗性差異來(lái)選擇雜種細(xì)胞；④生長(zhǎng)特性篩選法：利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。例如，常用IOA（核失活—碘乙酰胺）處理與培養(yǎng)基相結(jié)合進(jìn)行選擇：A親本用IOA處理，使細(xì)胞質(zhì)不活化，這樣A原生質(zhì)體不能分裂；使用的培養(yǎng)基是不利于B親本再生的培養(yǎng)基，這樣B原生質(zhì)體也不能再生，最后能再生的只能是A + B 體細(xì)胞雜種；⑤物理特性篩選法：利用親本原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電脈差異率等差異選擇雜種細(xì)胞；

[例3]：（2001上海高考題）現(xiàn)有甲、乙兩個(gè)煙草品種(2N=48)，其基因型分別為aaBB和AAbb，這兩對(duì)基因位于非同源染色體上，且在光照強(qiáng)度大于800勒克斯時(shí)，都不能生長(zhǎng)，這是由于它們中的一對(duì)隱性純合基因(aa或bb)作用的結(jié)果。取甲乙兩品種的花粉分別按圖示操作培養(yǎng)成植株，將它們的葉肉細(xì)胞制成原生質(zhì)體，并將兩者相混，使之融合，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)。然后，放到大于800勒克斯光照下培養(yǎng)，結(jié)果有的細(xì)胞團(tuán)不能分化，有的能分化發(fā)育成植株。

（1）在大于800勒克斯光照下培養(yǎng)，有_______種細(xì)胞團(tuán)不能分化。

（2）能分化的細(xì)胞團(tuán)是由__________的原生質(zhì)體融合來(lái)的(這里只考慮2個(gè)原生質(zhì)體的相互融合)。

（3）由該細(xì)胞團(tuán)分化發(fā)育成的植株，其染色體數(shù)是_______，基因型是_________。

（4）該植株自交后代中，在大于800勒克斯光照下，出現(xiàn)不能生長(zhǎng)的植株的概率是_________

[解析]：根據(jù)題意，基因型aaBB和AAbb的個(gè)體在光照強(qiáng)度大于800勒克斯時(shí)都不能生長(zhǎng)，這是由于它們中的一對(duì)隱性純合基因(aa或bb)作用的結(jié)果，我們可推測(cè)出：能生長(zhǎng)的植株一定同時(shí)含A、B基因。本題可用遺傳互補(bǔ)篩選法解題，見右圖所示。甲品種aaBB產(chǎn)生的花粉aB，花藥離體培養(yǎng)成的植株為aB，乙品種AAbb產(chǎn)生的花粉Ab，花藥離體培養(yǎng)成的植株為Ab，它們的葉肉細(xì)胞制成原生質(zhì)體，將兩者相混融合，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)有aaBB、AAbb 、AaBb，只有AaBb在光照強(qiáng)度大于800勒克斯下能生長(zhǎng)。AaBb的個(gè)體自交后代中出現(xiàn)不能生長(zhǎng)的植株的基因型aa___或___bb的個(gè)體，能生長(zhǎng)的植株基因型是AABB、AaBb、AABb、AaBB，由于AaBb的個(gè)體能產(chǎn)生四種配子其比例相等，其后代產(chǎn)生AABB的比例為1/4×1/4=1/16、AaBb為l/2×1/2=1/4、AABb為l/4×1/2=1/8、AaBB為l/2×1/4=1/8，這些個(gè)體之和為9/16，其余為能生長(zhǎng)的個(gè)體，其比例為7/16。

[答案]：（1）2 （2）甲乙兩品種 （3）48 AaBb （4）7/16

2.2單克隆抗體的制備中雜交瘤細(xì)胞的篩選

2.2.1雜交瘤細(xì)胞的第一次篩選

B淋巴細(xì)胞與骨髓細(xì)胞的融合隨機(jī)性很大，因此，細(xì)胞融合過(guò)程中將會(huì)形成多種細(xì)胞的混合體，包括B淋巴細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、B—B融合細(xì)胞、骨髓瘤—骨髓瘤融合細(xì)胞、B—骨髓瘤融合細(xì)胞（即雜交瘤細(xì)胞）和細(xì)胞多聚體（容易死亡，無(wú)需篩選）。在細(xì)胞混合體中，只有B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義，所以必須從不同種類的細(xì)胞中篩選出雜交瘤細(xì)胞。目前常采用HAT選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，其原理是：DNA的合成有D和S兩種途徑。B淋巴細(xì)胞具有D和S兩種DNA合成途徑，但一般不分裂增殖；骨髓瘤細(xì)胞只有一種DNA合成途徑，即D途徑，可無(wú)限增殖；雜交瘤細(xì)胞具有D和S兩種DNA合成途徑，它利用其中任何一個(gè)途徑都可無(wú)限增殖。由于HAT選擇培養(yǎng)基是在普通培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物質(zhì)配制而成，由于氨基喋呤可阻斷D途徑，僅有D合成途徑的骨髓瘤細(xì)胞及其彼此融合的細(xì)胞就不能增殖，而且B淋巴細(xì)胞一般不增殖，淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜交瘤細(xì)胞可以利用淋巴細(xì)胞中的S途徑合成DNA而增殖。所以多種不同形式細(xì)胞的混合體在HAT選擇培養(yǎng)液中，只有雜交瘤細(xì)胞能存活下來(lái)并不斷增殖。

2.2.2雜交瘤細(xì)胞的第二次篩選

由于實(shí)驗(yàn)小鼠在注射目標(biāo)抗原前，其體內(nèi)已存在大量的病原體，因此小鼠體內(nèi)會(huì)存在大量的針對(duì)不同種類抗原的免疫B淋巴細(xì)胞。所以在細(xì)胞融合時(shí)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞的種類也很多，但是只有與目標(biāo)抗原有特異性的免疫B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才是所需要的。第二次篩選的常用方法：①放射性免疫測(cè)定：用于可溶性抗原細(xì)胞的單克隆抗體的檢測(cè)；②酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等的單克隆抗體的檢測(cè)；③免疫熒光試驗(yàn)：用于細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體的檢測(cè)。利用上述方法選出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。

[例4]：1975年科學(xué)家首次利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體。請(qǐng)觀察下圖，回答問題：

（1）1984年以來(lái)，科學(xué)家針對(duì)如右圖所示的單克隆抗體來(lái)自_________，應(yīng)用于人體，會(huì)作為__________產(chǎn)生___________，加速排斥反應(yīng)，以及完整的抗體分子的相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)大，難以穿透腫瘤組織，達(dá)不到有效治療的濃度等問題，制備出可用于腫瘤治療的相對(duì)分子質(zhì)量小的單克隆抗體。

（2）制備單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞一般從 _______（器官）中采集。從下表看，用于篩選雜交瘤細(xì)胞的是特定的__________培養(yǎng)基。

[解析]：（1）目前，動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)最重要的用途是制備單克隆抗體，但不能理解為用書中介紹的例子——B淋巴細(xì)胞與老鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，已經(jīng)能夠生產(chǎn)人類的單克隆抗體。由于單克隆抗體上仍帶有鼠的抗原決定簇，患者仍然有可能產(chǎn)生針對(duì)于單克隆抗體的抗體，因此交叉反應(yīng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)及過(guò)敏反應(yīng)這一問題仍未得到解決?，F(xiàn)在的目標(biāo)是獲得高藥效低免疫性的人類單克隆抗體。（2）要制備針對(duì)某一目標(biāo)抗原的單克隆抗體，必須用高純度（純度越高越好）的該目標(biāo)抗原刺激實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（小白鼠）。由于脾是B淋巴細(xì)胞聚集的重要場(chǎng)所，無(wú)論以何種免疫方式刺激，脾臟內(nèi)皆會(huì)出現(xiàn)明顯的抗體應(yīng)答反應(yīng)。因此，小鼠脾細(xì)胞內(nèi)含大量的效應(yīng)B淋巴細(xì)胞（針對(duì)該目標(biāo)抗原的）。用于篩選雜交瘤細(xì)胞的是特定的選擇培養(yǎng)基。

[答案]：（1）鼠異物免疫反應(yīng) （2）脾選擇