基因A型和C型鴨甲型肝炎病毒卵黃抗體的研制及應(yīng)用

王繼練，張煥容，王　棟

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041)

?

基因A型和C型鴨甲型肝炎病毒卵黃抗體的研制及應(yīng)用

王繼練，張煥容*，王棟

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041)

旨在研制基因A型和C型鴨甲型肝炎病毒(DHAV)單價及二價高免卵黃抗體，以滿足實際生產(chǎn)中基因A型和C型DHAV單獨或混合感染防控的需要。采用基因A型和C型DHAV強毒株作為抗原制備單價和二價油乳劑滅活疫苗免疫接種高產(chǎn)蛋雞，制備了高效價的基因A型和C型DHAV單價及二價高免卵黃抗體，卵黃抗體鴨胚中和效價在1∶204與1∶281之間，單價及二價卵黃抗體防治試驗證明，所制備的卵黃抗體防治效果良好。

鴨甲型肝炎病毒；基因型；卵黃抗體；防治

鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是由鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)引起的雛鴨的一種致死率高且傳播迅速的急性、敗血性傳染病，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最主要的疫病之一。臨床上引起DVH的病原統(tǒng)稱為DHV。DHV分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3種血清型，其中血清Ⅰ型DHV又稱為鴨甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)，DHAV又分為A、B和C 3種基因型[1]，3種基因型之間無交叉免疫保護。我國目前流行的DVH主要由基因A型和C型DHAV引起，預(yù)防和控制該病毒的方法主要有弱毒疫苗免疫、高免血清或卵黃抗體防治[2]。由于弱毒疫苗免疫接種后產(chǎn)生保護性抗體需要一定的時間[3]，而DVH主要發(fā)生在3周齡以內(nèi)的雛鴨，1周齡以內(nèi)雛鴨感染病死率極高，雛鴨最好通過母源抗體獲得保護，母源抗體低的雛鴨可通過注射高免血清或卵黃抗體進行預(yù)防或緊急治療。因此，弱毒疫苗或滅活疫苗主要用于免疫種鴨以便后代雛鴨獲得高水平的母源抗體。高免血清分離自免疫動物的血液，而卵黃抗體僅需收集免疫蛋雞所產(chǎn)的雞蛋，在雞蛋的卵黃中即含有高水平的特異性抗體，因高免血清產(chǎn)量有限，生產(chǎn)成本高，相比較而言，卵黃抗體的生產(chǎn)成本遠遠低于高免血清[4]。卵黃抗體已廣泛應(yīng)用于動物疫病的防治[5]，已證實鴨肝炎病毒高免卵黃抗體用于鴨病毒性肝炎的防治效果良好。本研究旨在制備基因A型和C型DHAV單價和二價高免卵黃抗體用于鴨病毒性肝炎的防治。

1　材料與方法

1.1材料

鴨胚半數(shù)致死量(ELD50)10-5.356/0.1 mL的基因A型DHAV(DHAV-A)A4強毒株、ELD5010-5.568/0.1 mL的基因C型DHAV(DHAV-C)C2強毒株，均由西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)實驗室分離、鑒定并保存；SPF鴨胚，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；17周齡伊莎蛋雞，購自成都正大有限公司溫江蛋雞養(yǎng)殖場。

1.2方法

1.2.1DHAV-A和DHAV-C單價和二價佐劑疫苗的制備將1 000×ELD50的DHAV病毒液加入終濃度1 mL/L的福爾馬林溶液混勻，于37 ℃滅活16 h后，加入終濃度40 mL/L的吐溫-80，充分混勻后得到滅活病毒液，滅活病毒液與弗氏佐劑按1∶1體積比混合乳化制備單價滅活苗；等量的1 000×ELD50的DHAV-A和DHAV-C混合物2體積與1體積弗氏佐劑混合乳化制備二價滅活苗。

1.2.2蛋雞免疫開產(chǎn)前3周(17周齡)的健康伊莎蛋雞12只隨機分成4組，每組3只，分別為DHAV-A單價苗免疫組、DHAV-C單價苗免疫組、二價苗免疫組及不免疫對照組。疫苗免疫劑量及間隔時間如下：第1次免疫采用弗氏完全佐劑疫苗胸部肌肉注射，每只1 mL。第1次免疫后10 d進行第2次免疫，第2次和第3次免疫采用弗氏不完全佐劑疫苗頸部皮下注射，每只2 mL，第2次和第3次免疫間隔為10 d。三免后10 d進行第4次免疫，單價免疫苗組分別采用1 000×ELD50DHAV-A和DHAV-C強毒1 mL翅靜脈注射加強免疫，二價苗免疫組同時靜脈注射上述2種強毒各1 mL。

1.2.3卵黃抗體的制備及效價檢測第4次加強免疫后7 d開始收集雞蛋取其卵黃液，于卵黃液中加入等體積的生理鹽水充分混合均勻后，12 000 r/min離心10 min取上清，每亳升上清液加入100單位的青霉素、鏈霉素(雙抗)即為卵黃抗體。將1 000×ELD50/mL病毒液與2倍系列稀釋的不同稀釋度的卵黃抗體按1∶1均勻混合后置37 ℃恒溫箱中感作1 h后，每枚鴨胚接種0.2 mL，接種后放入37 ℃孵化箱孵育觀察，除去24 h內(nèi)死亡的胚外，記錄7 d內(nèi)鴨胚存活數(shù)和死亡數(shù)。根據(jù)Reed-Muench法計算卵黃抗體的中和效價。

1.2.4基因A型和C型DHAV卵黃抗體預(yù)防和治療試驗基因A型和C型DHAV卵黃抗體預(yù)防和治療試驗分組及處理見表1和表2。預(yù)防試驗為先注射卵黃抗體后24 h攻毒；治療試驗為攻毒24 h后注射卵黃抗體。

2　結(jié)果

2.1基因A型和C型DHAV單價和二價卵黃抗體效價

取第4次加強免疫后7 d～14 d內(nèi)產(chǎn)的蛋制備得到的卵黃抗體效價檢測結(jié)果見表3、表4、表5和表6。DHAV-A單價卵黃抗體中和效價為1∶281，DHAV-A和DHAV-C二價卵黃抗體中DHAV-A中和效價1∶204，DHAV-C單價卵黃抗體中和效價1∶240，DHAV-A和DHAV-C二價卵黃抗體中DHAV-C中和效價1∶213。

表1　卵黃抗體預(yù)防試驗分組及處理

表2　卵黃抗體治療試驗分組及處理

表3　DHAV-A單價卵黃抗體中和效價

按照Reed-Muench法計算，能保護50%的鴨胚免于死亡的抗體稀釋度介于10-2.2和10-2.5之間。距離比例=(70-50)/(70-47)=0.86，高于50%保護率抗體稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)，即-2.2+0.86×(-0.3)=-2.45，-2.45的反對數(shù)=281，即1∶281稀釋的抗體可保護50%的鴨胚免于死亡，即為該抗體50%的中和價。

表4　DHAV-A和DHAV-C二價卵黃抗體中DHAV-A中和效價

按照Reed-Muench法計算，能保護50%的鴨胚免于死亡的抗體稀釋度介于10-2.2和10-2.5之間。距離比例=(60-50)/(60-33)=0.37，高于50%保護率抗體稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)。即-2.2+0.37×(-0.3)=-2.31，-2.31的反對數(shù)=204，即1∶204稀釋的抗體可保護50%的鴨胚免于死亡，即為該抗體50%的中和價。病毒對照組全部死亡，空白對照組全部存活。

表5　DHAV-C單價卵黃抗體中和效價

按照Reed-Muench法計算，能保護50%的鴨胚免于死亡的抗體稀釋度介于10-2.2和10-2.5之間。距離比例=(65-50)/(65-40)=0.60，高于50%保護率抗體稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)。即-2.2+0.60×(-0.3)=-2.38，-2.38的反對數(shù)=240，即1∶240稀釋的抗體可保護50%的鴨胚免于死亡，即為該抗體50%的中和價。

表6　DHAV-A和DHAV-C二價卵黃抗體中DHAV-C中和效價

按照Reed-Muench法計算，能保護50%的鴨胚免于死亡的抗體稀釋度介于10-2.2和10-2.5之間。距離比例=(65-50)/(65-33)=0.46，高于50%保護率抗體稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)，即-2.2+0.46×(-0.3)=-2.33，-2.33的反對數(shù)=213，即1∶213稀釋的抗體可保護50%的鴨胚免于死亡，即為該抗體50%的中和價。病毒對照組全部死亡，空白對照組全部存活。

2.2卵黃抗體對雛鴨的預(yù)防效果

卵黃抗體對雛鴨的預(yù)防試驗結(jié)果見表7。每組10只雛鴨中，DHAV-A單價卵黃抗體試驗組死亡1只，DHAV-C單價卵黃抗體試驗組無死亡，DHAV-A和DHAV-C雙價卵黃抗體試驗組死亡2只，3個對照組的30只雛鴨全部死亡，不處理對照組全部存活。3種卵黃抗體的保護率分別為：DHAV-A單價卵黃抗體保護率90%，DHAV-C單價卵黃抗體保護率100%，DHAV-A和DHAV-C雙價卵黃抗體保護率80%。

2.3卵黃抗體治療試驗結(jié)果

卵黃抗體對雛鴨的治療試驗結(jié)果見表8。每組10只雛鴨中，DHAV-A單價卵黃抗體組死亡2只，DHAV-C單價卵黃抗體組死亡1只，DHAV-A和DHAV-C雙價卵黃抗體組死亡2只，對照組的30只雛鴨全部死亡，不處理對照組全部存活。3種卵黃抗體的治愈率分別為：DHAV-A單價卵黃抗體治愈率80%，DHAV-C單價卵黃抗體90%，DHAV-A和DHAV-C雙價卵黃抗體治愈率80%。

表7　雛鴨注射卵黃抗體后攻毒發(fā)病情況統(tǒng)計

表8　雛鴨攻毒后注射卵黃抗體發(fā)病情況統(tǒng)計

3　討論

卵黃抗體是鴨病毒性肝炎預(yù)防和治療最常用的生物制品[6-7]，為獲得高效價的卵黃抗體，應(yīng)采用高品質(zhì)免疫原、有效的佐劑及恰當?shù)拿庖唛g隔時間。許多因素會影響高品質(zhì)免疫原的獲得[8-9]，最重要的因素是抗原量和所使用的佐劑，以及抗原是否與佐劑充分混合，免疫原的制備效果能直接影響免疫原刺激免疫應(yīng)答的力度和最終的抗體效價。王岳[10]采用從淄博市分離到的Ⅰ型鴨肝炎病毒免疫接種雞制備得到的卵黃抗體對發(fā)病鴨群進行治療，總體保護率可達94.6%。張占龍等[11]采用自行分離的基因A型和C型鴨甲型肝炎病毒研制了雙價卵黃抗體，取得了良好的防治效果。本研究采用基因A型和C型DHAV強毒株作為抗原制備的單價和二價油乳劑滅活疫苗免疫高產(chǎn)蛋雞后，獲得了高效價的基因A型和C型DHAV單價及二價高免卵黃抗體，單價及二價卵黃抗體防治試驗證明所制備的卵黃抗體防治效果良好，這為基因A型和C型DHAV引起的鴨病毒性肝炎的綜合防控提供了理論依據(jù)和實踐參考。

[1]Wang L,Pan M,Fu Y,et al.Classification of duck hepatitis virus into three genotypes based on molecular evolutionary analysis [J].Virus Genes,2008,37(1): 52-59.

[2]張雪,龔文孝,胡勇,等.Ⅰ型鴨肝炎病毒基因C型株的分離與鑒定[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2015,36(1):23-26.

[3]張小飛,黃顯明,尹秀鳳,等.鴨肝炎病毒A66弱毒株的水平傳播感染[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,27(4):813-817.

[4]高嶺,劉聚祥,楊娜娜.雞卵黃抗體及其在養(yǎng)豬業(yè)中的應(yīng)用研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2013,34(5):110-114.

[5]張輝,崔煥忠,楊歡,等.卵黃抗體及其在疾病防制與飼料中的應(yīng)用研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2014,41(5)124-127.

[6]陳賢德,汪洋.鴨病毒性肝炎病毒高免卵黃抗體的免疫攻毒保護試驗[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2013(12):97-98.

[7]郭全海,趙香菊,王偉龍.鴨肝炎病毒的分離、鑒定及其卵黃抗體高效制備研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2013(17):112-115.

[8]Broderson J R．A retrospective review of lesions associated with the use of Freund's adjuvant [J]．Lab Anim Sci，1989，39(5):400-405.

[9]Mallon F M，Graichen M E，Conway B R，et al．Comparison of antibody response by use of synthetic adjuvant system and Freund complete adjuvants in rabbits [J]．Am J Vet Res，1991，52 (9):1503．

[10]王岳.淄博市鴨病毒性肝炎的綜合防治研究[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[11]張占龍,李敏,宋永鴻,等.鴨甲肝病毒基因A型和C型雙價卵黃抗體的研制與保護效果研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2015(17):222-224.

Development and Application of Egg Yolk Antibodies Against Hepatitis A Virus Genotypes A and C

WANG Ji-lian,ZHANG Huan-rong,WANG Dong

(College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu, Sichuan，610041,China)

The objective of this study was to develop monovalent and bivalent egg yolk antibodies against duck hepatitis A virus genotypes A and C to meet the requirement of prevention and treatment of duck viral hepatitis caused by duck hepatitis A virus genotypes A and C.Firstly,virulent duck hepatitis A virus genotype A and C strains were used as antigens to prepare monovalent and bivalent duck hepatitis A virus genotype A and C inactivated vaccine in oil-emulsion with Freud's adjuvant.Then the vaccines were used to immunize layer hens to produce immunized eggs for preparing highly immunized egg yolk antibodies.The good experimental prevention and treatment effects were acquired with both monovalent and bivalent egg yolk antibodies.

Duck hepatitis A virus; genotype; egg yolk antibody; prevention and treatment

2016-01-17

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目(2014NZYQN58);獸醫(yī)專業(yè)學(xué)位研究生教育實踐基地建設(shè)項目

王繼練(1989-)，男，貴州盤縣人，碩士研究生，主要從事動物疫病防治研究。*通訊作者

S852.659.6；S858.32

A

1007-5038(2016)09-0043-06