論狂犬病疫苗的研究進(jìn)展

王根龍　成建忠

摘要 概述了狂犬病疫苗的研究進(jìn)展，以期為合理應(yīng)用疫苗及了解其發(fā)展趨勢(shì)提供參考。

關(guān)鍵詞 狂犬病；傳統(tǒng)疫苗；細(xì)胞疫苗；新型疫苗；研究進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào) R512.9903 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2009）05-0223-02

1 傳統(tǒng)疫苗

1885年巴斯德嘗試用感染狂犬病毒固定毒的兔脊髓并于室溫干燥，經(jīng)此制備的疫苗試驗(yàn)后在1885年首次應(yīng)用于人并獲得了成功。1908年Fermi通過(guò)在室溫下用1%酚處理組織改進(jìn)了巴斯德的方法。1911年Semple 應(yīng)用羊腦組織的勻漿物制備疫苗，提高了疫苗的易感性。應(yīng)用化學(xué)方法如酚、β－丙內(nèi)脂制備了無(wú)毒性的Semple 疫苗。我國(guó)自1949年起，一直使用由山羊腦組織制備的Semple 疫苗，直到1980年停止使用，由原代地鼠腎細(xì)胞和BHK細(xì)胞疫苗取代。腦組織疫苗由于注射量大（每針2mL），接種次數(shù)多（14針以上），接種后易引起神經(jīng)變態(tài)反應(yīng)，抗體產(chǎn)生慢而且水平低等原因，WHO狂犬病專(zhuān)家委員會(huì)在第七次報(bào)告（1984年）中支持限制和放棄生產(chǎn)腦組織疫苗，并極力提倡使用滅活的細(xì)胞培養(yǎng)疫苗。

2 細(xì)胞疫苗

2.1 人二倍體細(xì)胞疫苗（HDCV）

1964年Wiktor在Wistar研究所首次描述HDCV，并進(jìn)一步通過(guò)比較試驗(yàn)最終將來(lái)源于Semple疫苗生產(chǎn)用PM狂犬病毒株適應(yīng)到W1～38人二倍體細(xì)胞株（后來(lái)又適應(yīng)到MRC 5細(xì)胞）。該疫苗于1974年首次獲準(zhǔn)生產(chǎn)，并于1978年開(kāi)始商品化。HDCV不含任何神經(jīng)毒因子，并不含任何外源動(dòng)物雜質(zhì)，因而可以解釋它在重復(fù)注射后較好的耐受。采用NIH法檢測(cè)疫苗的穩(wěn)定性證實(shí)，疫苗在4℃和37℃放置1個(gè)月后，無(wú)明顯差異。進(jìn)一步將5批效價(jià)為4.3～5.6的疫苗4℃存放3.5年，所有批號(hào)滴度均大于2.5IU/劑。早期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，HDCV預(yù)防接種后1個(gè)月或3個(gè)月達(dá)到抗體峰值（10IU左右），隨后便逐漸降低，但1～2年內(nèi)滴度始終大于0.5IU，通過(guò)1～3年內(nèi)加強(qiáng)免疫后，抗體滴度迅速增加10～15倍，肌肉注射和皮下注射途徑相近。

人二倍體細(xì)胞（HDC）為正常核型細(xì)胞，無(wú)致癌性，并且由于HDCV所具有的高免疫原性和良好的耐受性，目前在美國(guó)、加拿大、大多數(shù)歐洲國(guó)家和幾個(gè)亞洲國(guó)家使用，這使其成為評(píng)價(jià)任何一種人用新疫苗的標(biāo)準(zhǔn)疫苗[1]。HDCV的缺點(diǎn)在于HDC不太容易培養(yǎng)，而且狂犬病毒在HDC上培養(yǎng)的病毒滴度相對(duì)較低，僅能在空間有限的細(xì)胞瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，這使得疫苗的價(jià)格非常昂貴。在美國(guó)，用HDCV暴露后處理一個(gè)療程費(fèi)用高達(dá)1 000多美元；而在巴基斯坦，用羊腦組織苗（SemPle疫苗）進(jìn)行全療程處理只需2.5美元，這樣就限制了該疫苗在發(fā)展中國(guó)家的使用。

2.2 原代細(xì)胞培養(yǎng)疫苗

用地鼠腎細(xì)胞組織培養(yǎng)狂犬病毒發(fā)展滅活疫苗首先由Kissling提出并由Fenje進(jìn)一步發(fā)展，將SAD狂犬病毒固定毒適應(yīng)到地鼠腎細(xì)胞（PHKC）上生產(chǎn)滅活的疫苗，并獲得成功。1968年該疫苗在加拿大批準(zhǔn)用于人體加強(qiáng)和暴露前接種。

我國(guó)的PHKCV由衛(wèi)生部武漢生物制品研究所林放濤領(lǐng)導(dǎo)的小組研制而成。試驗(yàn)開(kāi)始所用毒種為北京株兔腦固定毒，經(jīng)“混合細(xì)胞培養(yǎng)法”在PHKC上適應(yīng)，連續(xù)傳50～60代適應(yīng)成功；再經(jīng)豚鼠腦和PHKC交替3次傳代的毒株稱(chēng)為aG株。aG株病毒在PHKC上培養(yǎng)收獲，福爾馬林滅活，加Al（OH）3佐劑。疫苗規(guī)定效價(jià)為1.3～2.5IU，經(jīng)超濾濃縮后，濃縮疫苗效價(jià)需＞2.5IU。經(jīng)臨床試驗(yàn)證明，各種劑型的PHKCV在人體中的抗體反應(yīng)均優(yōu)于羊腦Semple疫苗。目前，原代地鼠腎細(xì)胞狂犬病疫苗（PHKC－RV）在我國(guó)、原蘇聯(lián)及部分東歐國(guó)家使用。我國(guó)的PHKC－RV使用量大，占全世界所有各種細(xì)胞疫苗總使用量約80%，其有效性已被大量實(shí)驗(yàn)室與臨床觀察結(jié)果充分證實(shí)，并受到國(guó)外學(xué)者的首肯。我國(guó)的PHKC－RV有佐劑疫苗、佐劑濃縮疫苗與凍干濃縮疫苗3種，均已納入國(guó)家規(guī)程。為盡量減少可能出現(xiàn)的副作用，少量生產(chǎn)的濃縮疫苗宜進(jìn)行精制。

Van Wezal等1978年使用狂犬病毒PM株適應(yīng)到狗腎細(xì)胞，并使用了微載體以使疫苗大規(guī)模生產(chǎn)。疫苗對(duì)暴露前后的人體接種試驗(yàn)在荷蘭進(jìn)行，獲得的免疫反應(yīng)和HKCV具可比性，并于1980年獲準(zhǔn)在荷蘭生產(chǎn)?？袢《綪U11株在牛腎原代細(xì)胞上培養(yǎng)31代作為毒種，用胎牛腎原代細(xì)胞培養(yǎng)收獲病毒，經(jīng)滅活、濃縮、純化后制作的牛腎細(xì)胞疫苗，抗體效價(jià)達(dá)5～25IU，采用6針?lè)庖?，該疫苗已在法?guó)批準(zhǔn)用于暴露前和暴露后預(yù)防接種[2]。1983年Barth等從日本疫苗分化出一種用Flary LEP株適應(yīng)到雞胚細(xì)胞上的純化雞胚細(xì)胞疫苗（PCECV）。培養(yǎng)病毒采用β－丙內(nèi)酯滅活，并經(jīng)蔗糖梯度區(qū)帶離心純化和濃縮。該疫苗目前由德國(guó)Chiro Behring GmbH公司生產(chǎn)。人體暴露前后的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，疫苗的免疫效果和HDCV相當(dāng)，并且不會(huì)誘生針對(duì)雞細(xì)胞蛋白的抗體，使用該疫苗僅產(chǎn)生輕微的局部反應(yīng)。

2.3 傳代細(xì)胞系疫苗

2.3.1 非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）疫苗。1984年由法國(guó)Merieun研究所研制成功。制備過(guò)程中采用了使細(xì)胞貼附在微載體上懸浮培養(yǎng)的微載體技術(shù)以便進(jìn)行工業(yè)化大罐培養(yǎng)。該疫苗使用的病毒株與HDCV相同，為PM1503-3M。收獲的病毒經(jīng)超濾濃縮、密度梯度離心β-丙內(nèi)酯滅活制成凍干疫苗。早期研究證實(shí)，在100個(gè)接種的試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)沒(méi)有病毒轉(zhuǎn)移，每劑疫苗的殘余細(xì)胞DNA量小于50pg，疫苗的穩(wěn)定性極好，與HDCV相似。大量試驗(yàn)證實(shí)無(wú)論用作暴露前人體免疫或暴露后處理，Vero疫苗均獲得了很好的免疫效果。由于Vero細(xì)胞較HDC能生產(chǎn)較高的狂犬病毒滴度，并可利用微載體技術(shù)進(jìn)行工業(yè)化大罐培養(yǎng)，因而其價(jià)格較HDCV便宜。但是用Vero細(xì)胞制備疫苗需在低細(xì)胞代數(shù)使用以確保無(wú)致瘤性，且殘余細(xì)胞DNA量需小于100pg/劑。我國(guó)從1995年開(kāi)始進(jìn)行色譜純化的人用Vero細(xì)胞疫苗的研制。制備過(guò)程中使用的病毒株是適應(yīng)到Vero細(xì)胞的狂犬病毒CTN-1。目前已有包括衛(wèi)生部上海生物制品研究所在內(nèi)的多家生物制品研究所研制成功，并獲得生產(chǎn)文號(hào)，以逐步取代我國(guó)現(xiàn)行的地鼠腎細(xì)胞疫苗。

2.3.2 幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK細(xì)胞）疫苗。早在20世紀(jì)70年代就有利用懸浮生長(zhǎng)的BHK細(xì)胞感染Flary LEP株病毒生產(chǎn)滅活的獸用狂犬疫苗的報(bào)道。進(jìn)入90年代后，法國(guó)巴斯德研究所將生物反應(yīng)器應(yīng)用到BHK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，制備1種試驗(yàn)狂犬病疫苗。制備時(shí)使用了1種PV Paris/BHK21狂犬病毒適應(yīng)株，并采用了1種新的無(wú)血清培養(yǎng)基，這種試驗(yàn)疫苗在小鼠體內(nèi)獲得了滿(mǎn)意的保護(hù)活力。他們進(jìn)一步使用這種簡(jiǎn)單的BHK狂犬病疫苗在人類(lèi)志愿者中進(jìn)行了初步試驗(yàn)，證實(shí)該疫苗有好的免疫原性和耐受性。注射給地鼠后完整的BHK細(xì)胞是致瘤的，但當(dāng)以病毒滅活的濃度用β－丙內(nèi)酯處理細(xì)胞后，這種腫瘤原性便被除掉。另外，通過(guò)現(xiàn)有的純化技術(shù)，殘余的細(xì)胞DNA可降到最低量。BHK細(xì)胞是狂犬病毒的高產(chǎn)細(xì)胞，并可在生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)，這一途徑有助于那些希望開(kāi)始制備細(xì)胞疫苗的發(fā)展中國(guó)家生產(chǎn)獸用和人用狂犬病疫苗。

3 新型疫苗

利用基因重組技術(shù)，狂犬病毒中起主要免疫作用的糖蛋白及核蛋白已在不同的載體系統(tǒng)中得到表達(dá)。這些載體包括痘病毒、腺病毒、桿狀病毒、質(zhì)粒DNA等。有望最終發(fā)展成為安全有效的人用基因工程疫苗。

4 參考文獻(xiàn)

[1] COX JH，B DIETZSCHOLD，L G SCHNEIDER.Rabies virus glyc-oprotein II.Biological and serological characterization[J].Infect Immun，1997（16）：751.

[2] LAO TR，MINAMOTO N，ITO H，et al.A virus～neutralizing epitope on the glycopmtein of rabies virus that contains Trp251 is a linear epitope[J].Virus Res，1997，51（1）：35.