細(xì)胞培養(yǎng)教學(xué)中的常見問題及應(yīng)對措施

蔣林彬 劉健翔 蘇何玲

關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng);實驗教學(xué);評價標(biāo)準(zhǔn)

中圖分類號: G642.42;R394 文獻(xiàn)標(biāo)識碼: B 文章編號: 1008-2409(2009)06-1127-03

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)今生命科學(xué)各研究領(lǐng)域的基本技術(shù),是生命科學(xué)工作者必備的實驗 技能。細(xì)胞培養(yǎng)的成敗受細(xì)胞生長的各種條件,個人操作手法、操作環(huán)境、使用器具等多種 因素的影響[1]。在多年的教學(xué)實踐中,筆者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)過程一些常見的問題直 接影響到教學(xué)的順利進(jìn)行,針對這些問題,筆者采取了一些應(yīng)對措施,取得了較好的效果。

1 細(xì)胞培養(yǎng)教學(xué)中的一些常見問題

1.1 培養(yǎng)的細(xì)胞易 被污染

離體培養(yǎng)的細(xì)胞沒有抗感染能力,因此防止污染是細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。筆者在教 學(xué)中發(fā)現(xiàn)因各種因素導(dǎo)致學(xué)生培養(yǎng)的細(xì)胞被污染的比例達(dá)30%~40%。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)對操作環(huán)境要求高,不易組織教學(xué)

細(xì)胞培養(yǎng)需要在無菌室的超凈臺中進(jìn)行,空間較小,教師無法面對大量的學(xué)生進(jìn)行實驗示教 ,因此在組織教學(xué)上有一定的困難。

1.3 實驗過程較長,操作步驟多,不易監(jiān)控

細(xì)胞培養(yǎng)實驗的特點是實驗的前期準(zhǔn)備工作多,實驗過程長,操作步驟多。進(jìn)行一 輪完整的實驗,往往需數(shù)天時間,而且在實驗過程中,學(xué)生來做實驗的時間不固定,因此教 師不容易對學(xué)生的實驗全過程進(jìn)行監(jiān)控。

1.4 實驗評價標(biāo)準(zhǔn)單一,不適于這一類實驗的教學(xué)

以往對學(xué)生細(xì)胞培養(yǎng)實驗的評價是以學(xué)生培養(yǎng)的細(xì)胞的生長狀況和實驗報告為依據(jù),其缺陷 是只注重結(jié)果而忽視實驗的過程,而學(xué)生是否真正掌握細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),主要體現(xiàn)在實驗的過 程中。

筆者曾在中國科學(xué)院生物物理研究所、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部、解放軍傳染病研究所等國內(nèi)一些重 點實驗室學(xué)習(xí)和進(jìn)修,雖然細(xì)胞培養(yǎng)只是這些實驗室最基礎(chǔ)的一種技術(shù),但其做細(xì)胞培養(yǎng)實 驗的一些有益的經(jīng)驗非常值得參考和借鑒。筆者針對在教學(xué)中學(xué)生經(jīng)常出現(xiàn)的一些影響實驗 教學(xué)的問題,綜合這些經(jīng)驗,提出了相應(yīng)的處理對策。

2 應(yīng)對措施

2.1 完善細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)施,規(guī)范實驗操作步驟

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)室應(yīng)單獨隔離出來專用,能建立一定清潔級別的培養(yǎng)室是最好 的,考慮到用于教學(xué)的實驗室需要較大的面積,可能不易達(dá)到這樣的清潔級別要求,但至少 要有一個潔凈的環(huán)境和隔離出一個專用的無菌區(qū)[2]。

2.1.2 定期為培養(yǎng)室和超凈臺消毒,檢測細(xì)胞培養(yǎng)各種儀器是否正常運轉(zhuǎn)。

2.1.3 超凈工作臺應(yīng)保持清潔及寬敞,只放置本次實驗用的物品,以利于氣流的流通。從外面拿進(jìn)超凈工作臺未經(jīng)滅菌的物品須先用75%酒精擦拭。實驗操作 應(yīng)在臺面的中央無菌區(qū)域(酒精燈火焰周圍直徑15~20cm內(nèi)),不要在邊緣及通風(fēng)口等處操 作。全部實驗完畢后,將實驗物品帶出工作臺,用75%酒精擦拭臺面后再用紫外線照射30min 。

2.1.4 操作前要按要求洗手,準(zhǔn)備已消毒的帽子、口罩、手套、一次性鞋套。 然后更換消過毒的隔離服,通常學(xué)生實驗由于人數(shù)多,難以準(zhǔn)備大量的消毒隔離服,可以讓 學(xué)生換上自己平時實驗穿的干凈白大衣。對學(xué)生強調(diào)應(yīng)注意自身的安全,對于來自人類或病 毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心,操作過程中應(yīng)避免引起懸浮微粒的產(chǎn)生,小心毒性藥品,避免 尖銳器的傷害等。操作時動作要準(zhǔn)確敏捷,盡量不要說話,打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。

2.1.5 要保證器具和試劑的無菌。所用的各種試劑提前30min從冰箱取出預(yù)溫。 小心取用無菌的實驗物品,任何時候不要用手和吸管接觸瓶口,同時開啟的容器瓶口之間避 免相互接觸。移液用的各種吸管要專管專用,并且要勤換吸管。每次操作只處理一株細(xì)胞株 ,即使培養(yǎng)基相同也不共用培養(yǎng)基,以避免混淆或造成細(xì)胞之間污染[3]。在教學(xué) 中的做法是將所用試劑根據(jù)用量分成小包裝,不同的實驗組各用自己的一套試劑,這樣既能 節(jié)省試劑,又能控制交叉污染。

2.2 實驗示教問題的解決

在解決教師無法面對大量的學(xué)生進(jìn)行實驗示教的問題時,筆者采用在實驗之前組織 學(xué)生觀看實驗教學(xué)錄像片,用多媒體示教的方式講解實驗要求,讓學(xué)生熟悉每一步操作的細(xì) 節(jié)。與此同時為每實驗小組配備一套與實際操作完全一樣的實驗用具(可以用未經(jīng)高壓滅菌 的器具),模擬進(jìn)行操作。

2.3 實驗過程中的一些細(xì)節(jié)問題的解決方法

2.3.1 細(xì)胞實驗的步驟和用 品多 常見到學(xué)生做實驗時由于準(zhǔn)備不充分而導(dǎo)致手忙腳亂,因此實驗前的準(zhǔn)備非常重要。筆者的 做法是指導(dǎo)學(xué)生養(yǎng)成下列習(xí)慣:實驗前一定要熟悉實驗的內(nèi)容和要求,然后各實驗組制作實 驗操作小卡片,在卡片上注明本次實驗所需要的物品名稱、規(guī)格、數(shù)量(準(zhǔn)備的實驗器材要 稍多于實際使用數(shù)量)、操作步驟及要領(lǐng)、注意事項等。在實驗前按照卡片的內(nèi)容一一清點 實驗所需的用品,確認(rèn)無誤以后才進(jìn)行實驗。寫有實驗步驟、注意事項的卡片可以貼在超凈 臺外面方便看到的地方,以便隨時查看。

2.3.2 超凈臺中物品擺放不合適 在操作時,由于超凈臺中物品擺放不合適,導(dǎo)致取用不方便。應(yīng)提供一個參考的 物品擺放模 式:超凈臺中常用的物品如廢液缸置操作區(qū)的右后方,裝75%酒精棉球瓶置于左側(cè),酒精燈 則放在正中央,酒精燈與操作者之間20cm內(nèi)為主要操作區(qū)域,試管架,剪刀,鑷子等常備物 品根據(jù)個人習(xí)慣選擇固定的位置放好,以方便取用為原則。

2.3.3 細(xì)胞消化不足或過度 這是一個最常見的由非污染引起的細(xì)胞培養(yǎng)不好的原因。貼壁細(xì)胞在消化傳代時,使用相同 的消化酶,即使同一批細(xì)胞,各組學(xué)生培養(yǎng)的細(xì)胞生長狀況也不一樣,其消化的時間也不盡 相同。有些學(xué)生加進(jìn)消化液后在細(xì)胞還沒有被充分消化下來時就用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞,結(jié)果 是細(xì)胞沒被吹下來,還造成細(xì)胞破碎。有些學(xué)生的細(xì)胞消化過度,吸棄消化液體時將部分細(xì) 胞一起棄去造成損失。筆者的做法是不用統(tǒng)一計時的方法來估計細(xì)胞消化的程度,加入消化 液后放在顯微鏡下觀察,待細(xì)胞出現(xiàn)分離變圓即終止消化[3]。

2.4 對預(yù)防污染反應(yīng)過度而影響實驗的進(jìn)行

大多數(shù)情況下,經(jīng)過教師的反復(fù)強調(diào),學(xué)生的無菌意識得到很大的增強。但是常見到學(xué)生對 預(yù)防污染反應(yīng)過度,反而造成細(xì)胞培養(yǎng)的失敗。

2.4.1 將用消毒布包拿進(jìn)超凈臺才打開取出 正確的做法是將消毒布包中已消 毒的物品在超凈臺的外面打開,直接取出放入操作臺中,用紫外照射10min,然后啟動工作 臺的吹風(fēng)機抽風(fēng)。

2.4.2 把消毒包中已經(jīng)消過毒的器械又用75%酒精棉球擦 拭 其實酒精的消毒效果遠(yuǎn)沒有高壓好,這樣做不僅增加了操作步驟和時間,還有可能帶來污染 [4]。

2.4.3 反復(fù)燒烤已經(jīng)高壓滅菌的用品 在使用已經(jīng)高壓過的培養(yǎng)瓶 時用酒精燈反復(fù)燒烤瓶口,或在操作時將已經(jīng)吸過細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清等還繼續(xù)使用的吸 管在酒精燈上反復(fù)燒烤。同樣增加了不必要的操作步驟,而且殘留在吸管內(nèi)的物質(zhì)在燒焦后 ,形成對細(xì)胞生長有害的碳化物,再取液時帶入培養(yǎng)液后會對細(xì)胞產(chǎn)生毒害。

2.4.4 灼燒浸泡在75%酒精中的金屬器械 浸泡在酒精中的金屬器械,在超凈臺中取出后,用火燒的目的只是為了去除沾在上面的酒精 ,故無須灼燒太久,長時間在火焰上灼燒后,常有學(xué)生因使用沒有完全冷卻的器具而燙傷細(xì) 胞[5,6]。

2.5 建立學(xué)生自主實驗?zāi)Ｊ郊跋鄳?yīng)實驗室管理制度

由于細(xì)胞培養(yǎng)實驗過程較長,教師不可能時刻跟在每一個實驗組后面指導(dǎo),因此嘗試通過建 立學(xué)生自主實驗?zāi)Ｊ降耐緩浇鉀Q這個問題,具體做法是讓學(xué)生在觀察自己培養(yǎng)的細(xì)胞的同時 ,相互檢查其他實驗組,記錄細(xì)胞培養(yǎng)狀況、實驗過程及結(jié)果。自主實驗?zāi)Ｊ降慕⒉粌H培 養(yǎng)了學(xué)生的自我管理能力,也為以后學(xué)生進(jìn)行設(shè)計性、創(chuàng)新性實驗打下了基礎(chǔ)。健全相應(yīng)的 實驗室管理制度,選擇一定數(shù)量的學(xué)生(如實驗小組長)參與實驗室管理工作,實驗室實施 全天性開放,讓學(xué)生在做實驗時根據(jù)需要能隨時進(jìn)入實驗室及拿到所需要的實驗用品,教師 則可在固定的時間在進(jìn)行指導(dǎo)。

2.6 建立新的評分體系以解決實驗評價標(biāo)準(zhǔn)單一的問題

傳統(tǒng)的實驗評價標(biāo)準(zhǔn)不適合這一類實驗的教學(xué)要求,達(dá)不到檢測是否真正掌握細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 的目的。筆者采用對學(xué)生進(jìn)行綜合考核評價,著重于學(xué)生實驗技能與實際操作水平的考核,分別在實驗過程中用提問、觀察學(xué)生的操作以及實驗結(jié)束后的實驗報告、研討等方式進(jìn)行考 核,這樣的考核貫穿于實驗的整個過程中,成績的評定既注重實驗結(jié)果更注重過程。

筆者在生物技術(shù)專業(yè)2002~2006級5屆學(xué)生中,對這一部分實驗內(nèi)容進(jìn)行教學(xué)改革,通過不斷 摸索,取得了一些實施的經(jīng)驗,從教學(xué)效果來看,發(fā)現(xiàn)這樣的教學(xué)方式有助于學(xué)生掌握實驗 技術(shù),學(xué)生也樂于接受,同時對其他實驗內(nèi)容的教學(xué)也有借鑒意義。

參考 文獻(xiàn):

[1] 鍔征.組織養(yǎng)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1986:1-5.

[2] JOHN R W,MASTERS.Animal Cell Culture [M].Third Edition OXF ORD UNIVERSITY PRESS,2000:2-17.

[3] 費洪新,孫麗慧,張濤,等.人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞培養(yǎng)的體會[J].衛(wèi) 生職業(yè)教育,2007,25(8):138-139.

[4] 司徒鎮(zhèn)強,吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng) [M].西安:世界圖書出版社西安公司,2007:11-13.

[5] 張卓然.實用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1999:2-6 .

[6] 王春景,劉玉琴,張宏,等.細(xì)胞培養(yǎng)操作中常見問題及處理對策 [J] .基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2009,29(3):335-336.

(收稿日期: 2009-10-12)

[責(zé)任編 輯 高莉麗 鄧德靈]