哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究

王　會　潘登奎

摘要介紹了轉(zhuǎn)基因哺乳動物的研究概況，綜述了哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)基本方法，外源基因的整合和表達(dá)，轉(zhuǎn)基因哺乳動物的檢測方法以及哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用和存在的問題。

關(guān)鍵詞轉(zhuǎn)基因哺乳動物；外源基因；轉(zhuǎn)基因技術(shù)

中圖分類號Q953+.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739（2009）06-0196-03、、

20世紀(jì)70年代開創(chuàng)的DNA重組技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用在生命科學(xué)的各個研究領(lǐng)域，并取得了豐碩的研究成果。轉(zhuǎn)基因哺乳動物自20世紀(jì)80年代初誕生以來，一直是生命科學(xué)研究和討論的熱點，隨著研究的不斷深入和實驗技術(shù)的不斷完善，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是20世紀(jì)遺傳學(xué)中繼連鎖分析、體細(xì)胞遺傳和基因克隆之后的第4代技術(shù)，是生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展史上126年中14個轉(zhuǎn)折點之一。

1轉(zhuǎn)基因哺乳動物的研究概況

1980年Gordon等首先采用受精卵原核注射方法，將皰疹病毒基因SV40DNA片段和PBR322原核DNA分別注射到小鼠受精卵的雄原核內(nèi)，移植受體后獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因小鼠。1982年P(guān)almiter等又將帶有小鼠MT啟動子的大鼠生長激素基因（rGH）導(dǎo)入小鼠受精卵，得到了21只小鼠，其中7只帶有目的基因，有6/7的小鼠比同窩對照組生長快近2倍，這些快速生長的轉(zhuǎn)基因小鼠被譽為“超級小鼠”（super mouse），表明整合了的外源基因可以在宿主體內(nèi)得到有效正確表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可以在宿主動物體內(nèi)行使正常的功能。

自此便掀起了培育轉(zhuǎn)基因動物的大潮，按照研究轉(zhuǎn)基因小鼠的思路，轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因綿羊、轉(zhuǎn)基因豬、轉(zhuǎn)基因山羊及轉(zhuǎn)基因牛都陸續(xù)育成。特別是1997年英國羅斯林研究所克隆羊“多莉”的誕生，突破了有性生殖的框架，表明高等動物也可以由無性生殖來繁殖。同年美國PPL公司和羅斯林研究所合作，利用該法生產(chǎn)出具乳腺表達(dá)人第九因子的綿羊[1]。

利用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)獲得了克隆豬、體內(nèi)含有外源基因的轉(zhuǎn)基因豬、體內(nèi)有2個基因被“關(guān)閉”了的轉(zhuǎn)基因克隆豬和基本不含人體免疫排斥基因的“基因敲除”克隆豬等[2]。

我國從1984年開始轉(zhuǎn)基因動物研究，并于同年最先獲得了含人B2珠蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。1985年和1986年又分別獲得了含人生長激素（MT2hGH）基因的轉(zhuǎn)基因泥鰍和小鼠。1987年獲得含有大腸桿菌galk和gpt基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。以后又相繼獲得了含HbgAg乙型肝炎表面抗原基因的轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因豬、含EPO基因和人乙型肝炎表面抗原基因2種乳腺特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因山羊、含人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因山羊、含人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因奶牛、含“生物鋼”蛋白基因的轉(zhuǎn)基因老鼠[3]。

2哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)基本方法

2.1物理方法

主要包括顯微注射法、電激法、超聲波法、凍融法、基因槍法等，其中以顯微注射法使用最為廣泛，多數(shù)轉(zhuǎn)基因動物是通過該方法獲得的。顯微注射法是用微吸管在顯微操作儀下將一定量的外源基因直接注入到受精卵的雄原核中，將受精卵培養(yǎng)后移植給受體動物。1980年Gordon將SV40的TK基因整合后的質(zhì)粒以顯微注射法注入小鼠受精卵原核中，首次成功地培育出轉(zhuǎn)基因小鼠，隨后利用該方法，轉(zhuǎn)基因兔、豬、綿羊、魚、牛和山羊也都相繼獲得成功。這種方法的優(yōu)點是：外源基因易整合入染色體，導(dǎo)入的基因大，可使用任何載體承載基因片段，也可注射無載體的基因片段，外源基因的長度不受限制，可達(dá)100Kb，實驗周期相對比較短。但這一技術(shù)還存在明顯不足，由于基因整體進(jìn)入染色體的隨機性，使外源基因整合位點和拷貝數(shù)無法控制，需要昂貴精密的設(shè)備，操作復(fù)雜，需培訓(xùn)專門技術(shù)人員。盡管如此，由于其直接對基因進(jìn)行操作，整合率較高，因而仍是目前建立轉(zhuǎn)基因動物極為重要的方法。

2.2化學(xué)方法

主要包括磷酸鈣沉淀法、多聚陽離子試劑法、脂質(zhì)體包埋法和DEAE-葡聚糖法。目前，脂質(zhì)體包埋法是最佳的選擇。脂質(zhì)體是由雙分子層組成的閉合囊泡，通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用，將所攜帶的目標(biāo)基因?qū)爰?xì)胞中。自Felgner等（1987）首次用DOTMA/DOPE陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞成功以來，取得較大進(jìn)展，通過此方法獲得了轉(zhuǎn)基因山羊、綿羊、牛[4]。該方法效率很高，離體細(xì)胞可以瞬時表達(dá)外源基因，但其作用機理尚未完全闡明。Kawaura等（1998）發(fā)現(xiàn)，抑制細(xì)胞內(nèi)吞的物質(zhì)（如細(xì)胞松馳素）可最大程度地抑制轉(zhuǎn)染，說明轉(zhuǎn)染機制可能是細(xì)胞內(nèi)吞。該技術(shù)的優(yōu)越性表現(xiàn)在細(xì)胞毒性低，對外源基因片段大小無特殊要求，且脂質(zhì)體易于制備，尤其是免疫原性低，可在體內(nèi)轉(zhuǎn)染時使用與體外實驗相同的載體。目前，面臨的主要問題是轉(zhuǎn)染靶向性不強，易被吞噬細(xì)胞清除，血清的抑制作用以及轉(zhuǎn)化效率低等。

2.3生物方法

主要包括反轉(zhuǎn)錄病毒法、精子載體法、原生質(zhì)介導(dǎo)法、細(xì)胞融合法、胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cell，ESCs）法和人工酵母染色體載體法。

2.3.1反轉(zhuǎn)錄病毒法。反轉(zhuǎn)錄病毒是病毒中的一個大科，其成員可感染許多不同種屬的動物。它與其他病毒的區(qū)別在于其復(fù)制是通過一個DNA中間體，即前病毒來完成的。中間體是反轉(zhuǎn)錄病毒生命周期的一個組成部分。反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶，能以RNA病毒基因組作為模板產(chǎn)生雙股的DNA拷貝，單一拷貝能有效地插入宿主細(xì)胞的基因組中。反轉(zhuǎn)錄病毒具有能將其病毒基因插入宿主細(xì)胞染色體中的能力，加上其能對多種細(xì)胞類型的非溶解性感染，使之成為基因轉(zhuǎn)移實驗的理想載體。并且利用反轉(zhuǎn)錄病毒的高感染效率和在DNA上高度整合的特性，可以提高生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的效率。早在1974年，就有關(guān)于反轉(zhuǎn)錄病毒作為動物基因轉(zhuǎn)移載體的研究。Janenisch等將SV40DNA注入小鼠囊胚腔中，發(fā)現(xiàn)獲得的小鼠體內(nèi)有SV40DNA整合。隨后，他又成功地用鼠白血病病毒作為載體，將外源基因?qū)胄∈笈咛?。Harvey等用貓白血病病毒作為載體，成功地將外源基因?qū)肴ネ该鲙У难蚺咛ブ衃5]。Anthony等認(rèn)為以反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因整合的關(guān)鍵在于有絲分裂時出現(xiàn)的核膜分裂，處于減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞無核膜的時間遠(yuǎn)長于處于有絲分裂M期的細(xì)胞，這就為反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因插入提供了可能[6]。

反轉(zhuǎn)錄病毒感染法的優(yōu)點是操作簡單，無需特別的儀器設(shè)備，外源基因的整合率較高， 效果穩(wěn)定，通常外源基因是單拷貝整合到受體基因組中，而且轉(zhuǎn)染不受胚胎發(fā)育階段限制。動物病毒所具有的啟動子不但可以引發(fā)一些選擇標(biāo)記基因的表達(dá)，還能引發(fā)所導(dǎo)入外源基因的表達(dá)[7]。這一技術(shù)的缺點在于外源基因難以植入生殖系統(tǒng)，成功率較低；病毒衣殼大小有限，不能插入大的外源DNA片斷；感染宿主時，為非同源整合，結(jié)合不穩(wěn)定；調(diào)控區(qū)內(nèi)可能會發(fā)生相互作用，這就要求選擇能穩(wěn)定整合表達(dá)的外源基因，并用高感染力的反轉(zhuǎn)錄病毒作載體；最關(guān)鍵的是攜帶外源基因的病毒載體在導(dǎo)入受體細(xì)胞基因組過程中有可能激活細(xì)胞DNA序列上的原癌基因或其他有害基因，安全性令人擔(dān)擾。

2.3.2精子載體法。精子載體法是將成熟的精子與外源DNA進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)后，使精子攜帶外源基因，受精后并使外源基因能整合到受精卵染色體中。此項技術(shù)在實際操作中存在許多問題，但在思路上對大型動物的轉(zhuǎn)基因研究具有重要的意義，目前，在豬、雞、魚類等的基因轉(zhuǎn)移中已獲得成功，關(guān)鍵之處在于精子與外源DNA的結(jié)合[8]。

2.3.3ESCs法。ESCs法是將目的基因轉(zhuǎn)移入ESCs后，再重新導(dǎo)入囊胚或經(jīng)篩選后對轉(zhuǎn)入外源基因的ESCs進(jìn)行克隆，從而培育出轉(zhuǎn)基因個體。ESCs法的最大特點是，在克隆的ESCs被轉(zhuǎn)移到動物胚胎之前，可先把外源重組DNA整合到細(xì)胞的染色體組中，然后將這些胚胎干細(xì)胞進(jìn)行篩選，找到理想的ESCs，從而大幅提高轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)效率。但ESCs法的缺點是ESCs建株很困難，同時還需要預(yù)先選擇和克隆基因轉(zhuǎn)移型細(xì)胞。目前，利用該方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物有2個最大限制條件，一是只有小鼠的胚胎干細(xì)胞可供商業(yè)應(yīng)用；二是即使有了胚胎干細(xì)胞，對家畜來說繁殖嵌合體還有一定困難。

2.3.4人工酵母染色體載體法。人工酵母染色體載體是近年來發(fā)展起來的新型載體，具有克隆百萬堿基對級（Mb）大片段外源基因的能力，可以保證巨大基因的完整性，保證所有順式作用因子的完整并與結(jié)構(gòu)基因的位置關(guān)系不變，從而使得較長的外源片斷在轉(zhuǎn)基因動物研究中整合率的提高，另外，目的基因上下游的側(cè)翼序列可以消除或減弱基因整合的位置效應(yīng)[9]。技術(shù)關(guān)鍵為：胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染YAC后體篩選，陽性胚胎干細(xì)胞囊胚腔的注射，YAC原核注射[10]。1996年BermG通過此法獲得轉(zhuǎn)基因兔[11]。

3外源基因的整合和表達(dá)

3.1外源基因的整合

外源基因的整合受DNA構(gòu)型、進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式、DNA的濃度等的影響。外源基因進(jìn)入細(xì)胞后整合方式不同，可分為隨機整合與定點整合。整合一般具有穩(wěn)定性，大部分以孟德爾方式遺傳后代，少部分嵌合體，極少轉(zhuǎn)基因未整合到染色體上，而是以附加體形式存在，并可傳至后代。1～100拷貝的外源基因以頭尾成串的方式整合到宿主細(xì)胞的染色體上，一般為單位點整合，有時在不同染色體的不同位點整合。目前，認(rèn)為基因表達(dá)的強弱與整合的拷貝數(shù)無關(guān)，而與整合位置有關(guān)。另外，原核生物的載體序列可能會抑制某些基因的表達(dá)，少數(shù)基因位點的側(cè)翼序列有重排現(xiàn)象，或基因部分整合情況。外源基因插入常出現(xiàn)宿主基因序列的重排、缺失、重復(fù)或異位，轉(zhuǎn)基因可能會造成宿主細(xì)胞基因突變出現(xiàn)新表現(xiàn)型，有時會影響管家基因以至發(fā)育致死[12，13]。

3.2外源基因的表達(dá)

從基因到蛋白是一個多因素作用的生化過程，尤其是對隨機插入宿主染色體的外源基因，其表達(dá)與否或表達(dá)程度強弱除受其本身結(jié)構(gòu)影響外，整合位點的位置及附近順式調(diào)控元件的有無都對外源基因表達(dá)產(chǎn)生影響。另外，轉(zhuǎn)基因沉默、RNA的錯誤剪接、原核載體序列及動物的遺傳背景等也是外源基因不表達(dá)或表達(dá)水平低的原因。

外源基因表達(dá)很大程度上受整合位點的影響，所謂“位置效應(yīng)”即是因整合位點不同而導(dǎo)致的基因表達(dá)差異。對位置效應(yīng)最直接的解釋是插入位點附近的序列特點影響了其表達(dá)的程度[14]。比如，如果外源基因插入轉(zhuǎn)錄失活的異染色質(zhì)區(qū)域，則其表達(dá)有可能受到完全抑制。目前，使用的酵母人工染色體（YAC）介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因，因保證了目的基因上下游側(cè)翼序列的完整性，可在一定程度上減弱位置效應(yīng)。

3.3提高外源基因表達(dá)的策略

3.3.1導(dǎo)入大片段目的基因。YAC載體是近年來發(fā)展起來的新型載體，它的大容量為處理大片段DNA提供了有力的武器。YAC載體不存在位置效應(yīng)，因YAC載體的大容量能保證巨大基因的完整性，保證所有順式作用因子的完整性，另外，目的基因上下游的側(cè)翼序列可以消除或減弱基因整合后的“位置效應(yīng)”而引起緩沖區(qū)域的作用，從而提高外源基因的表達(dá)水平。

3.3.2添加內(nèi)含子。結(jié)構(gòu)基因有3種形式：一是基因組基因，包括外顯子和內(nèi)含子；二是微型基因，也是基因組基因，但大部分的內(nèi)含子都已去除；三是不包含內(nèi)含子的cDNA。大量的試驗結(jié)果表明，基因組DNA在轉(zhuǎn)錄遷移方面優(yōu)于cDNA及微型基因。Grosveld等研究人β-球蛋白基因在轉(zhuǎn)基因鼠中表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，第2內(nèi)含子對于表達(dá)是必需的，而采用cDNA構(gòu)件，由于缺乏內(nèi)含子，外源基因在轉(zhuǎn)基因鼠中未能激活，在所進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄遷移實驗中，采用含有內(nèi)含子的基因組構(gòu)件比采用cDNA的表達(dá)率提高表達(dá)10～100倍，說明內(nèi)含子有利于基因的轉(zhuǎn)錄[12]。

3.3.3利用啟動子和增強子。啟動子是RNA聚合酶進(jìn)行精確有效轉(zhuǎn)錄必需的。在轉(zhuǎn)基因動物研究中如何選配設(shè)計啟動子是決定外源基因在受體細(xì)胞中能否正確表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。有時為了增強基因的特異表達(dá)，還必須設(shè)計出單一型增強子或復(fù)合型增強子與之匹配[12]。

3.3.4利用反式作用因子。動物基因的表達(dá)除受到順式作用元件作用外，還受到反式作用因子的調(diào)節(jié)。這些反式作用因子是可擴散并能與調(diào)控序列結(jié)合的蛋白因子或激素類物質(zhì)，是由調(diào)控序列結(jié)構(gòu)基因以外的基因編碼的，在順式元件的調(diào)控序列上有其特異的結(jié)合位點，是調(diào)控序列實現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控過程中不可缺少的功能性分子。反式作用因子不僅能激活不同外源基因的轉(zhuǎn)錄，而且能結(jié)合到染色體的不同位點。將一個基因的調(diào)控序列與另一個基因的結(jié)構(gòu)序列重組可以產(chǎn)生新的組織特異表達(dá)，1個反式作用因子可以對幾個基因的表達(dá)起作用，同時它也具有組織特異性[13]。

3.3.5添加基質(zhì)附著區(qū)?；|(zhì)附著區(qū)（Matrix Attachment R-egion，MAR）又稱核骨架附著區(qū)（Scaffold Attachment R-egion，SAR）。S/MAR是指染色體上能專一性地與核骨架結(jié)合的DNA片段，該區(qū)域為A T豐富區(qū)，通常含拓?fù)洚悩?gòu)酶II保守序列。S/MAR有時能顯著增強基因表達(dá)、克服位置效應(yīng)和消除轉(zhuǎn)基因沉默，它已越來越多的被作為一種重要的順式調(diào)控元件應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因工程中。

3.3.6利用基因打靶系統(tǒng)實現(xiàn)外源基因的定點整合。轉(zhuǎn)基因動物中外源基因在染色體上的整合狀態(tài)與該基因的表達(dá)調(diào)控關(guān)系極大。一般情況下，外源基因幾乎全部都以隨機插入的方式整合在受體細(xì)胞中染色體的隨機位點上，因而幾乎所有的轉(zhuǎn)基因動物都面臨遺傳穩(wěn)定性差、易引起插入突變和基因修飾并導(dǎo)致遺傳病變等問題[14]。近年來，國內(nèi)外在這方面作了大量工作，設(shè)計出了多種基因打靶系統(tǒng)，使外源基因在受體細(xì)胞中定點整合在特異染色體的其特異位點上，從而基本上消除了隨機整合帶來的問題。另外，基因打靶與胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)合，可方便地將各種突變引入生物體內(nèi)，從而在整體水平上研究高等真核生物基因的表達(dá)調(diào)控。

4轉(zhuǎn)基因哺乳動物的檢測方法

檢測方法通常采用的是不同層次的分子雜交法，如基因水平的DNA印記法（Southern Blot）、轉(zhuǎn)錄水平的RNA印記法（Northern Blot）、翻譯水平的蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）、斑點雜交法（Spot Hy-bridization），也可采用基因定位法（Gene Location），一般情況下多種檢測方法聯(lián)合使用。

4.1DNA印記法（Southern Blot）

DNA印記法是轉(zhuǎn)基因動物鑒定的主要方法，也是目前最具權(quán)威的方法。技術(shù)要點為：提取組織DNA，選擇導(dǎo)入基因中的單一限制酶位點，酶切后電泳，轉(zhuǎn)膜并選擇適當(dāng)?shù)奶结樳M(jìn)行雜交，通過放射自顯影獲得結(jié)果。優(yōu)點是結(jié)果明確可靠，缺點是操作繁瑣、工作量大。

4.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）

該法需設(shè)計一對特異性引物，以提取組織DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，檢測是否有特異性片段。由于PCR方法有時存在假陽性，特別是擴增出的內(nèi)源性片段對轉(zhuǎn)基因的篩選影響較大時，假陽性更明顯。因此，如何消除PCR假陽性是一個重要問題。

4.3斑點雜交法（Spot Hybridization）

提取待檢動物組織DNA點于硝酸纖維素膜上，用探針雜交，放射自顯影后獲得雜交結(jié)果。該法存在一些問題，如整合的外源基因與內(nèi)源性基因有同源性時，往往出現(xiàn)假陽性。另外，由于提取的染色體脫氧核糖核酸較為濃稠，加之整合拷貝數(shù)低，雜交效果有時不太理想。因此，該法雖十分簡單，但很少用于轉(zhuǎn)基因動物篩選[15]。

5哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用及存在的問題

動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用正走向產(chǎn)業(yè)化的道路，具有十分廣闊的前景。如動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)可用來改良動物品種[16]，提高生產(chǎn)性能，生產(chǎn)藥物蛋白[8]，用轉(zhuǎn)基因動物的器官作為人類器官移植的供體，建立診斷、治療人類疾病及新藥篩選的動物模型[17]。

但作為一個新興的技術(shù)，轉(zhuǎn)基因動物研究還面臨著一些亟需解決的問題。如轉(zhuǎn)基因動物的成活率低；轉(zhuǎn)基因動物在獲得生產(chǎn)性狀提高的同時，也留下一些后遺癥[18]；轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器所生產(chǎn)產(chǎn)品的安全性問題，對大自然生態(tài)平衡以及物種的多樣性產(chǎn)生的不良影響，轉(zhuǎn)基因動物器官移植可能會增加“人畜共患”病的傳播機會；轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)帶來的倫理道德問題等。雖然轉(zhuǎn)基因的研究仍存在諸多問題，但不可就此否定轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究價值。相信隨著研究工作的深入進(jìn)行，這些問題將會逐步得到解決。

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