植物組培室污染菌的調(diào)查及預(yù)防措施

●張紅利 （天水市果樹(shù)研究所 甘肅 天水 741000）

植物組織脫毒快繁技術(shù)已廣泛應(yīng)用于科研和生產(chǎn)，在果樹(shù)花卉苗木快繁、無(wú)病毒苗木培育、代謝物質(zhì)生產(chǎn)以及植物新品種培育和改良上發(fā)揮著重要作用。植物組培發(fā)展至今，已經(jīng)奠定了深厚的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)，但仍存在一些技術(shù)問(wèn)題，如組培瓶苗生產(chǎn)過(guò)程中的污染，在試管苗工廠化簡(jiǎn)化生產(chǎn)中對(duì)組培成本有著較大的影響。在植物組培實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，對(duì)污染菌的發(fā)生種類及生長(zhǎng)速度進(jìn)行了調(diào)查，并分析產(chǎn)生的原因，為植物組織培養(yǎng)污染防控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查地點(diǎn)及條件

調(diào)查于2019年在天水市果樹(shù)研究所植物組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)冬季有暖氣，其余季節(jié)為自然室溫，室內(nèi)周年溫度在18～32 ℃，最高溫度在5～7月。實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照組培操作管理制度，進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌、組培材料超凈工作臺(tái)無(wú)菌轉(zhuǎn)接，接種室、培養(yǎng)室用75%酒精噴灑1次/d，每周用必潔士（二氧化氯）熏蒸1次。

1.2 調(diào)查材料

調(diào)查材料選擇實(shí)驗(yàn)室大量生產(chǎn)的蘋(píng)果砧木珠美海棠試管苗。每月取100瓶擴(kuò)繁試管苗，調(diào)查污染菌種類和各污染菌的發(fā)生數(shù)量，計(jì)算各污染菌的發(fā)生率和整體污染率。

1.3 污染菌的生長(zhǎng)測(cè)定

使用珠美海棠擴(kuò)繁培養(yǎng)基，對(duì)產(chǎn)生的污染菌進(jìn)行分離純化，測(cè)定各污染菌的生長(zhǎng)速度。將培養(yǎng)基表面出現(xiàn)黏液狀菌斑的污染菌認(rèn)定為細(xì)菌；在培養(yǎng)基上出現(xiàn)絨毛狀菌絲，然后形成不同顏色孢子層癥狀的認(rèn)定為真菌。

1.3.1 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定用無(wú)菌移液器吸取測(cè)菌液0.2 mL，接種到9支空白液體培養(yǎng)基中。將接種后的液體培養(yǎng)基置于振蕩器上，在22 ℃條件下振蕩培養(yǎng)，分別在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h后取出，較早取出的可放在2 ℃低溫冰箱中冷藏。以未接種的空白液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，選用350～400 nm波長(zhǎng)的濾光片進(jìn)行比對(duì)。以光密度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪出生長(zhǎng)曲線圖。

1.3.2 真菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定用打孔器取大小一致的菌塊，每個(gè)菌種接種3個(gè)培養(yǎng)瓶。將接種培養(yǎng)瓶放置在16 h光照、24 ℃人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，記錄開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)間。分別測(cè)量培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d的菌落直徑。取3個(gè)重復(fù)平均值，繪制菌種在培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)室主要污染菌的發(fā)生調(diào)查

通過(guò)對(duì)珠美海棠試管苗污染菌發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)污染菌主要有4種（表1）。其中2種為細(xì)菌性污染菌，年平均污染率分別為0.83%和1.83%；2種為真菌性污染菌，年平均污染率分別為5%和4.5%；全年培養(yǎng)室污染率達(dá)到11.25%。月污染率最高期發(fā)生在4～7月，6月最高，達(dá)到26%。4～8月培養(yǎng)室溫度較高、濕度較大，最高溫度為32 ℃，實(shí)驗(yàn)室周邊因大樹(shù)遮陰，加上雨 季在6～8月，室內(nèi)濕度在80%以上。

表1 組培室周年試管苗污染統(tǒng)計(jì)情況

2.2 組培室發(fā)生菌的分離純化

對(duì)培養(yǎng)室出現(xiàn)的4種污染菌進(jìn)行分離純化培養(yǎng)（圖1），并分別測(cè)定生長(zhǎng)速率，繪制出生長(zhǎng)曲線（圖2和圖3）。

從圖2可以看出，2種細(xì)菌污染菌在液體培養(yǎng)基中，基本處于平直緩慢生長(zhǎng)狀態(tài)，擴(kuò)散速度較小，紅色細(xì)菌在4 h時(shí)有一個(gè)較快的生長(zhǎng)高峰，之后又趨于同步。

從圖3可以看出，2種真菌污染菌在第2～3天時(shí)達(dá)到快速生長(zhǎng)階段，第4天以后進(jìn)入緩慢擴(kuò)散生長(zhǎng)階段，2種真菌生長(zhǎng)速度基本同步，灰色真菌直徑略大于白色真菌。

3 污染菌的發(fā)生時(shí)間

由表1可知，該培養(yǎng)室污染主要發(fā)生在4～8月，此外，11月和12月也是污染高峰月。從結(jié)果來(lái)看，4～8月污染率分別為14%、20%、26%、14%、9%，11月和12月污染率分別為11%、9%。天水4～7月氣溫持續(xù)升高，6～8月為雨季，而11～12月因室內(nèi)有供暖，溫度維持在較高水平。說(shuō)明相同管理?xiàng)l件下，植物組培室污染菌的發(fā)生與培養(yǎng)溫度、濕度有較大的相關(guān)性。

4 污染防治

植物組培室污染防治：做好外植體滅菌、接種器械滅菌、培養(yǎng)環(huán)境消毒，嚴(yán)格按無(wú)菌操作規(guī)程操作。

4.1 保持培養(yǎng)室溫度的恒定

培養(yǎng)室溫度保持在（25±2）℃，在普通無(wú)恒溫條件的培養(yǎng)室，高溫季節(jié)在控制好培養(yǎng)室周邊環(huán)境衛(wèi)生的情況下，在無(wú)風(fēng)的清晨或傍晚，開(kāi)窗通風(fēng)降溫，促進(jìn)室內(nèi)空氣的流通。培養(yǎng)室濕度高于60%時(shí)，可通過(guò)除濕機(jī)除濕，減少因高溫、高濕引起的試管苗污染。溫濕度不好控制的培養(yǎng)室，可調(diào)整生產(chǎn)任務(wù)，在夏季高溫季節(jié)可進(jìn)行培養(yǎng)室的維修維護(hù)及春季新建初代少量材料童化期的培養(yǎng)，減少試管苗的大量生產(chǎn)，以達(dá)到降低污染、減少生產(chǎn)成本的目的。

4.2 及時(shí)處理污染材料

通過(guò)對(duì)2種細(xì)菌和2種真菌污染菌生長(zhǎng)結(jié)果的觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌在培養(yǎng)3 h后就進(jìn)入快速生長(zhǎng)，但整體擴(kuò)散面積小于真菌；真菌在培養(yǎng)3 d后進(jìn)入快速生長(zhǎng)，菌塊很快布滿整個(gè)培養(yǎng)基。對(duì)量少珍貴材料，在肉眼看到培養(yǎng)基表面有污染菌發(fā)生時(shí)，應(yīng)立即不沾帶培養(yǎng)基剪取莖尖，重新轉(zhuǎn)接到干凈培養(yǎng)基中，達(dá)到挽救材料、減少污染的培養(yǎng)目的。真菌污染材料要先于細(xì)菌材料轉(zhuǎn)接。

4.3 定期殺菌和消毒

對(duì)規(guī)?；a(chǎn)的培養(yǎng)室，接種室和培養(yǎng)室要定期熏蒸或噴霧，噴灑酒精或紫外線照射、臭氧機(jī)消毒。每天由專人監(jiān)測(cè)培養(yǎng)室瓶苗，隨時(shí)發(fā)現(xiàn)污染隨時(shí)拿出培養(yǎng)室，連同試管污染材料一起滅菌，然后清洗。用于下代轉(zhuǎn)接的試管苗，更應(yīng)仔細(xì)挑選，杜絕帶菌轉(zhuǎn)接，避免污染菌的群體滋生造成大的經(jīng)濟(jì)損失。