ＢＣＡ法測神奇靈顆粒劑中蛋白含量

曹玉華

【摘要】 目的 對神奇靈顆粒劑中的蛋白含量進行測定，建立一種快速測定藥品中蛋白含量的方法。方法 對樣品溶解、過濾后，采用BCA法，以牛血清白蛋白作為對照品，測定吸光度，并做精密度、樣品重現(xiàn)性、加樣回收實驗。結(jié)果 用本法得到樣品含量為48.09%，RSD=0.11%；平均回收率為98.81%，RSD=0.51%。結(jié)論 應(yīng)用BCA測蛋白法可作為含有蛋白的藥品制劑中蛋白含量的測定方法。

【關(guān)鍵詞】 BCA；蛋白質(zhì)；神奇靈顆粒劑お

【Abstract】 Objective To determine total protein in Shenqiling granules,and establish the methodology to assay protein level in drugs. Methods After filtering the samples,take bovine serum albumin as control article,use BCA to determine the absorbance,and then do the tests for precision,reproducibility,average recovery. Results The average content of the samples was 48.09% in the precision experiment,RSD=0.11%(n=6). The average recovery was 98.81%,RSD=0.51%. Conclusion The method in this paper can be used for determining protein in drugs.

【Key words】 BCA;Protein;Shenqiling granules

二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA ）法是近年來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與Lowry法相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu+。BCA與Cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的藍紫色復(fù)合物，在562 nm處有高的光吸收值并且與蛋白濃度成正比，據(jù)此可測算蛋白質(zhì)濃度。與Lowry法相比，BCA蛋白測定方法靈敏度高、操作簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點是受雜質(zhì)的影響較小^[1]。

神奇靈顆粒是由幾種中藥的水提取物，輔以乳清蛋白、蜂蜜等按一定比例加工成型的一種保健食品，具有改善機體免疫功能、調(diào)節(jié)人體的適應(yīng)狀態(tài)功能，適用于機體免疫功能低下，運動狀態(tài)下降以及體力虛弱等的人群，其中蛋白質(zhì)是主要的功效成分。《中國藥典》以及食品標(biāo)準(zhǔn)中傳統(tǒng)的方法是用凱氏定氮法，雖然測定準(zhǔn)確，但操作繁瑣費時，需經(jīng)過冗長的消化、蒸餾等處理過程，而且容易產(chǎn)生有毒的氣體，不適宜快速、簡便地測定一般食品藥品中的蛋白含量。本文采用BCA法測定神奇靈顆粒劑中蛋白的含量，從而為藥品檢測建立一種快速、準(zhǔn)確測定蛋白含量的方法。

1 材料

1.1 儀器 ELX-800型酶標(biāo)儀(美國寶特公司)；梅特勒AG285電子天平。

1.2 試劑 BCA蛋白測量試劑盒（北京天來生物醫(yī)藥科技有限公司）；神奇靈顆粒劑（廣東省體育科學(xué)研究所提供，批號20061107）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純，文中所用水均為二蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)BCA蛋白測量試劑盒說明書操作配制“工作液”。按50體積BCA試劑A溶液加1體積BCA試劑B溶液配制，充分混勻備用。

取試劑盒中蛋白標(biāo)準(zhǔn)品-牛血清蛋白10 μl，用0.9％生理鹽水90 μl稀釋，使終濃度為0.5 mg/ml，此即為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按0、1、2、4、8、12、16、20 μl加入到96孔平板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加0.9％NaCl補足到20 μl。向標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入200 μl BCA工作液，輕微振蕩，混勻于37℃恒溫水浴中溫育30 min。取出平板于酶標(biāo)儀上測定吸光度，測定波長為570 nm和595 nm。見圖1和圖2。

以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)（x）,進行回歸運算，求得曲線方程分別為y=1.71×10-2x+8.00×10-3，r=0.9838；y=4.82×10-2x+5.60×10-3，r=0.9996。可見當(dāng)波長為595 nm時，吸光度與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量相關(guān)系數(shù)好，r為0.9996。故選用波長為595 nm的方程。

2.2 樣品溶液的制備與測定 取一定量的本品，在研缽中研磨粉碎，精密稱取0.399 8 g，加水后超聲20 min使之溶解，過濾，定容至25 ml，取1 ml，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法，把樣品加入到96孔平板中的樣品孔中，測定吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)的含量。

2.3 重現(xiàn)性實驗 分別精密稱取6份樣品，加入到96孔平板的樣品孔中，依照樣品的測定方法，得到吸光度，計算蛋白質(zhì)的含量，計算平均值及RSD。見表1。

樣品平均含量為48.09%，RSD為0.11%，n=6。說明該方法測定該樣品誤差范圍較小，方法準(zhǔn)確性高，方法切實可行。

2.4 加樣回收實驗 精密稱取6份已知含量的樣品，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品試液，同供試品的方法定容于25 ml水制備，測定吸光度，計算平均回收率，及RSD。見表2。

平均回收率為98.81%，RSD=0.51%，說明該法以及在樣品處理過程中損失較少，操作可行性很大。

3 討論

蛋白含量測定方法有很多種，常見的有微量凱氏定氮法，利用被測的天然含氮化合物與濃硫酸共熱時分解出氨氣，氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨。在凱氏定氮儀中加入強堿堿化消化液，使硫酸銨分解出氨。用水蒸氣蒸餾法將氨蒸入無機酸溶液中，然后再用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液進行滴定，滴定所用無機酸的量（mol）相當(dāng)于被測樣品中氨的量（mol），根據(jù)所測得的氨量即可計算樣品的含氮量。蛋白含氮量通常在16%左右，所以將凱氏定氮法測得的含氮量乘以系數(shù)6.25，即可得到該樣品的蛋白質(zhì)含量；Lowry法，因為蛋白質(zhì)含有兩個以上的肽鍵（-CO-NH-），因此有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中，能與Cu2+形成絡(luò)合物。Folin酚反應(yīng)是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上，引進Folin試劑（磷鉬酸-磷鎢酸試劑），蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物能還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑，生成藍色物質(zhì)。在一定條件下，藍色強度與蛋白質(zhì)的量成正比；紫外分光光度法，是由于蛋白質(zhì)分子中芳香氨基酸的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有紫外吸收的性質(zhì)，吸收高峰在280 nm處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的吸光度與其含量成正比關(guān)系，因此可以定量測定；考馬斯亮藍染色法在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律，因此可以通過測定染料在595 nm波長處的光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。

參 考 文 獻

［1］ 莫姣嬌,孫強.昆蟲蛋白質(zhì)含量的測定方法.安徽農(nóng)學(xué)通報, 2007,13(11):40-42.

［2］ 王全喜,王一飛,楊珂，等.神奇靈顆粒劑中總蛋白含量測定的方法.時珍國醫(yī)國藥,2007,18(4)790-791.