ｐＴＡＴ－ＨＡ質(zhì)粒載體在受體菌ＤＨ５α中的轉(zhuǎn)化及鑒定

蔣常文　夏春波　徐雅娟　周　思　劉源劼　劉　靜

【摘要】 目的 探索pTAT-HA質(zhì)粒在受體菌DH5α中轉(zhuǎn)化的方法。方法 配制LB培養(yǎng)基，將pTAT-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α，培養(yǎng)篩選成功轉(zhuǎn)化子，電泳鑒定。結(jié)果 pTAT-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌可在Amp+LB培養(yǎng)基中生長，電泳結(jié)果顯示質(zhì)粒大小準(zhǔn)確無誤（約3000 bp）。結(jié)論 pTAT-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功，轉(zhuǎn)化菌可冷凍保存質(zhì)粒，提取的質(zhì)?？捎糜谙掠畏肿由飳W(xué)實(shí)驗(yàn)。

【關(guān)鍵詞】 pTAT-HA質(zhì)粒；DH5α；轉(zhuǎn)化

【Abstract】 Objective To explore the method thatDH5α was transformed with pTAT-HA vector.Methods LB medium was prepared,pTAT-XIAP vector was transformed into E.coli.DH5α.competent cells.Results Transformants were cultured on LB medium and selected.The plasmids were extracted,purified andidentified by agarose gel electrophoresis.Transformed DH5α Could grow on LB medium containing ampicillin,gel electrophoresis analysis showed that the molecular weight of pTAT-XIAP vector was about 3000 bp consistent withthe vector.Conclusion The pTAT-XIAP vector was succesfully transformed into the DH5α and the transformants were stored by cryopreservation,the purified plasmid could be used for molecular biologic experiments in the future.

【Key words】 pTAT-XIAP plasmid;DH5α;Bactria

轉(zhuǎn)化是在基因工程中向受體細(xì)胞導(dǎo)入外源基因的主要手段，在分子生物學(xué)研究中具有重要的作用，探索高效、快速轉(zhuǎn)化受體菌的方法是目的基因保存、擴(kuò)增和進(jìn)行后續(xù)研究的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)將pTAT-HA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化至DH5α受體菌，取得了成功，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 pTAT-HA質(zhì)粒（美國Steven F Dowdy惠贈(zèng)），DH5α感受態(tài)細(xì)胞（購自TIANGEN公司），Biospin質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒（BIOER公司，Cat＃ BSC01M1），無水乙醇，胰蛋白胨，酵母提取物，氯化鈉，瓊脂粉，氨芐青霉素。

1.2 方法

1.2.1 LB培養(yǎng)基的配制 胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，溶解并定容至1000 ml，調(diào)pH至7.4，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂粉，高壓滅菌。選擇培養(yǎng)基加氨芐青霉素至終濃度50 μg/ml。

1.2.2 pTAT-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與篩選 取100 ml DH5α感受態(tài)細(xì)胞于冰水浴，向感受態(tài)細(xì)胞中加入10 μl pTAT-HA質(zhì)粒DNA，冰浴靜置30 min，將離心管置于42℃水浴90 s，冰浴冷卻2~3 min，向離心管中加入900 μl LB液體培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃搖床震蕩培養(yǎng)45 min。取100 μl轉(zhuǎn)化菌液加到LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素），37℃培養(yǎng)12~16 h，照相。

1.2.3 pTAT-HA質(zhì)粒擴(kuò)增及鑒定 取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落接種至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，將1~1.5 ml菌液加入1.5 ml無菌EP管中，10 000轉(zhuǎn)/min離心30 s，棄上清，加250 μl Resuspension Buffer重懸菌體，加250 μl Lysis Buffer，輕柔顛倒4~6次，加350 μl Neutralization Buffer，立即輕柔顛倒4~6次，12 000轉(zhuǎn)/min離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移到Spin column內(nèi)，6 000轉(zhuǎn)/min離心1 min，棄接液管液體，加650 μl Wash Buffer，12 000轉(zhuǎn)/min離心30~60 s，棄接液管液體，再次于12 000轉(zhuǎn)/min離心1 min，將Spin column轉(zhuǎn)移至1.5 ml無菌EP管中。向Spin column內(nèi)加TE溶液50 μl，靜置1 min，于12 000轉(zhuǎn)/min離心1 min。取5 μl離心管內(nèi)液體于150 V電壓，1%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外透射儀觀察，凝膠成像系統(tǒng)照相。

2 結(jié)果

2.1 DH5α在LB固體培養(yǎng)基中的生長情況 培養(yǎng)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化菌液在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上呈分散菌落生長，在無氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上成片生長，DH5α感受態(tài)細(xì)胞（無pTAT-HA質(zhì)粒）在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上未見菌落生長，圖1。

2.2 pTAT-HA質(zhì)粒電泳結(jié)果 電泳結(jié)果顯示，pTAT-HA質(zhì)粒條帶大小與試劑說明書中的一致，無基因組條帶；未轉(zhuǎn)化的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中無質(zhì)粒DNA條帶，圖2。

3 討論

大腸桿菌DH5α菌株經(jīng)特殊工藝處理后得到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌細(xì)胞在低溫和低滲溶液中，菌細(xì)胞壁通透性增加，菌體膨脹成球形，此時(shí)轉(zhuǎn)化液中的DNA形成抗Dnase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物，粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)短暫的熱休克后容易進(jìn)入菌體細(xì)胞中［1］。熱休克溫度是決定轉(zhuǎn)化成敗及轉(zhuǎn)化效率高低的關(guān)鍵因素，溫度過低轉(zhuǎn)化效果不理想，過高使大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性過強(qiáng)，易導(dǎo)致質(zhì)粒的丟失，所以應(yīng)選擇42℃作為最佳熱休克溫度［2］。有報(bào)道［3］，轉(zhuǎn)化時(shí)間對轉(zhuǎn)化率的影響顯著，在15~60 min之間，隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)化率提高，而超過 60 min，轉(zhuǎn)化率則無進(jìn)一步的提高。本實(shí)驗(yàn)采用冰浴30 min，42℃熱休克作用90 s，冰浴冷卻2~3 min，37℃溫孵45 min可獲得較高的轉(zhuǎn)化效果。pTAT-HA質(zhì)粒中有抗氨芐青霉素基因，故含pTAT-HA質(zhì)粒的DH5α（轉(zhuǎn)化子）能在Amp+LB培養(yǎng)基中生長，其余不能存活。而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的DH5α在Amp+LB培養(yǎng)基中不能生長，說明在Amp+LB培養(yǎng)基中生長的DH5α是由外源基因（即pTAT-HA質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化成功發(fā)揮了作用。

在提取pTAT-HA質(zhì)粒進(jìn)行鑒定時(shí)，需注意提取的菌細(xì)胞不宜過多，否則會(huì)影響質(zhì)粒的質(zhì)量。加入菌體裂解液后不宜劇烈振動(dòng)、作用時(shí)間不宜過長（5 min），以防止基因組DNA被剪切，出現(xiàn)非特異性條帶，影響鑒定。本實(shí)驗(yàn)成功將pTAT-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，電泳鑒定明確的pTAT-HA質(zhì)粒可用于下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)或-20℃保存。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ 張果，昌曉紅，石菁菁，等.卵巢癌抗獨(dú)特型單鏈抗體6B11 scFv與鼠HSP70融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2008，3（5）：336-342.

［2］ 金文輝，郭焱，崔健麗，等.人卵GST-ZP3融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及其免疫原性的檢測.中國婦幼保健，2008，23（23）：3311-3314.

［3］ 郭英，曲章義.流感病毒RNA聚合酶PA亞基重組質(zhì)粒pQE32-PA-2轉(zhuǎn)化效率的實(shí)驗(yàn)研究.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，24（2）：221.