鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性及碳青霉烯酶的研究

馮紅軍　牛麗林　李花茹　付玉軍　牛勝利　米彩鋒

【摘要】 目的 了解鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥譜及碳青霉烯酶的研究。方法 用VITEK60型全自動(dòng)藥敏分析系統(tǒng)鑒定藥敏系統(tǒng)及紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)；PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析檢測(cè)碳青霉烯酶VIM、IMP、OXA-23和OXA-24。結(jié)果 217株鮑曼不動(dòng)桿菌中頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率最低，其次是亞胺培南，再者是頭孢他啶和哌拉西林/他唑巴坦；頭孢哌酮/舒巴坦和頭孢他啶的中介率分別是27.6%和19.8%； 20株亞胺培南耐藥菌中， PCR 擴(kuò)增VIM、IMP和OXA-24均陰性；OXA-23基因擴(kuò)增顯示19株（95%）陽(yáng)性，PCR產(chǎn)物并經(jīng)序列分析證實(shí)為OXA-23。結(jié)論 碳青霉烯類抗生素的長(zhǎng)期廣泛應(yīng)用使鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率不斷升高；產(chǎn)OXA-23型β-內(nèi)酰胺酶是本院鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南耐藥的重要原因。

【關(guān)鍵詞】 鮑曼不動(dòng)桿菌；碳青霉烯酶

The resistant characteristic and carbapenemases in acinetobacter baumannii

FENG Hong-jun, NIU Li-lin, LI Hua-ru,et al.The First Peoples Hospital of Pingdingshan， Henan 467000，China

【Abstract】 ObjectiveTo investigate the resistant characteristic and carbapenemases in acinetobacter Baumannii（Ab）.Methods Identification and analyses all specimens were identified by VITEK- 60, drug resistances were detected by VITEK- 60 , the drug resistance to SCF were detected by Kirby -Bauer test. PCR and DNA sequencing were performed to determine VIM，IMP，OXA-23 and OXA-24 β-lactamase. Results 217 strains, the resistance rate to sulperazone in 217 strains is the lowest, then to the Imipems ;The mid-drug-resistance rate of the sulperazone is 27.6%, and the ceftazidimes is 19.8%. Of the 20 imipenem resistance strains, VIM、IMP and OXA-24 β-lactamase genotype were all negative, PCR and sequencing found 19 strains（95%）produced OXA-23.Conclusion The resistance rates is increasing to advance as longer-term or broad to use carbopenem; OXA-23 production is the important resistance mechanism in Imipenem.

【Key words】 Acinetobacter baumannii；Carbapenemases

鮑曼不動(dòng)桿菌是引起院內(nèi)感染的重要病原菌,它對(duì)多種抗菌藥物耐藥, 臨床上治療比較困難。亞胺培南對(duì)不動(dòng)桿菌有較好的抗菌活性, 往往是鮑曼不動(dòng)桿菌院內(nèi)感染的首選抗菌藥物^[1]。但隨著亞胺培南在臨床的廣泛應(yīng)用, 對(duì)亞胺培南耐藥的不動(dòng)桿菌也日益增多^[2]。為了解亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在本院的耐藥性及流行情況,筆者對(duì)在本院收集到的亞胺培南耐菌株進(jìn)行耐藥性分析, 并對(duì)碳青霉烯酶基因進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 收集本院2005年12月至2006年12月間住院患者各類標(biāo)本中分離出多重耐藥菌株217株，其中來自痰液的159株，瘡口分泌物21株，尿液7株，腹水6株，血液5株，其他標(biāo)本26株。并取對(duì)亞胺培南耐藥菌株20株進(jìn)行碳青霉烯酶基因進(jìn)行了檢測(cè)。

1.2 分離培養(yǎng) 按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌(ATCC 25922)，銅綠假單胞菌(ATCC 27853)。

1.4 鑒定和耐藥譜的分析 用VITEK60型全自動(dòng)藥敏分析系統(tǒng)鑒定和檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性，用K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)SCF的耐藥性。頭孢哌酮/舒巴坦折點(diǎn)參考頭孢哌酮標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 酶基因PCR檢測(cè) 各酶基因擴(kuò)增所用引物序列為：blaIMP-A(CGGCC(G/T) CAGGAG(A/C)G(G/T)CTTT)和 blaIMP-B(AACCAGTTTTGC(C/T)TTAC(C/T)AT); blaVIM-A(AT TCCGGTCGG(A/G)GAGGTCCG)和blaVIM-B(GAGCAAGTCTAGACCGCCCG); blaOXA-23-A(GATGTG TCATAGTATTCGTCG)和blaOXA-23-B(TCACAACAACTAAAAGCACTG); blaOXA-24-A(CAAGAGCTTG CAAGACGGACT和blaOXA-24-B(TCCAAGATTTTCTAGC(A/G)ACTTATA。IMP-、VIM- 、OXA-23-、 OXA-23型金屬酶基因PCR反應(yīng)參數(shù)為93℃預(yù)變性2 min，然后按93℃1 min→55℃1 min→72℃1 min。共循環(huán)35周期。最后一個(gè)72℃延長(zhǎng)至2 min。產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 多重耐藥菌的耐藥性分析 在217株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中，頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率最低（24.4%），其次是亞胺培南（39.1%），再者是頭孢他啶（52.1%）和哌拉西林/他唑巴坦（55.7%）。 但頭孢哌酮/舒巴坦和頭孢他啶的中介率分別是27.6%和19.8%。與文獻(xiàn)報(bào)道不一致^[3]見表1。

2.2 碳青霉烯酶基因檢測(cè)顯示 20株菌株中，經(jīng)OXA-23特殊引物經(jīng)擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,在19株中出現(xiàn)了1 067 bp的陽(yáng)性條帶（見圖1），此PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的序列進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn), 所有PCR產(chǎn)物100%與OXA-23 基因同源。未能擴(kuò)增出VIM、IMP和OXA-24基因。同時(shí)擴(kuò)增了4株亞胺培南敏感株，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)OXA-23均為陰性。

3 討論

近年來隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素等廣譜抗菌藥物的廣泛使用，誘導(dǎo)了大量鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥株的產(chǎn)生，其臨床分離率也越來越高，并形成了對(duì)單一抗菌藥物耐藥到多重耐藥甚至全耐，由低耐藥率到高耐藥率的發(fā)展和變遷。本研究中顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)第一、二代頭孢菌素幾乎耐藥，對(duì)三代頭孢菌素除頭孢他定稍低外，其他都達(dá)60％以上，并且對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類耐藥率有上升的趨勢(shì)。對(duì)頭孢他啶的耐藥率較低，可能由于頭孢他啶對(duì)β-內(nèi)酰胺酶有高度穩(wěn)定性和有效血藥濃度持續(xù)時(shí)間較短的原因。在加入β-內(nèi)酰胺酶抑制劑舒巴坦、他唑巴坦后，抗菌藥物的耐藥率下降，成為治療多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的一線藥物。哌拉西林和氨芐西林同屬青霉素類，哌拉西林本身抗菌活性強(qiáng)于氨芐西林，但氨芐西林/舒巴坦的協(xié)同作用優(yōu)于哌拉西林/他唑巴坦。表明所產(chǎn)生的β－內(nèi)酰胺酶活性多能被舒巴坦抑制, 但其而較少被克拉維酸和他唑巴坦抑制，舒巴坦對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用優(yōu)于他唑巴坦。這可能與他唑巴坦抑酶譜窄有關(guān)。

碳青霉烯酶是指能夠明顯水解亞胺培南或美羅培南的一類β-內(nèi)酰胺酶，它包括Ambler分子分類為A、B、D的3類酶。從不動(dòng)桿菌中分離出的碳青霉烯酶按Ambler分類法主要分為B和D兩類。B類酶主要是指金屬酶。金屬酶需要金屬離子如Zn2+等的轉(zhuǎn)移表現(xiàn)其催化活性。根據(jù)氨基酸的同源性，Bush又把金屬酶分成三組結(jié)構(gòu)亞型B1, B2, B3^[3]在鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的主要是B1亞型，包括IMP類以及VIM類。目前在不動(dòng)桿菌屬中只發(fā)現(xiàn)了四種IMP類金屬酶IMP-1, IMP-3和IMP-4, IMP-7^[4，5]。其活性不被克拉維酸等抑制劑所抑制,但可被EDTA所抑制。它們具有很強(qiáng)的水解碳青霉烯類抗菌藥物的能力，是導(dǎo)致臨床治療失敗的又一大原因。2002年韓國(guó)Yum等^[6]在不動(dòng)桿菌中又發(fā)現(xiàn)了位于整合子中的VIM-2，與IMP酶的同源性<30%，但兩者具有相同的動(dòng)力學(xué)特征，能水解除氨曲南以外的所有的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，其基因也位于有轉(zhuǎn)移能力的整合元件上。D類碳青霉烯酶即OXA酶,屬Bush-J-M功能分類2 d群。目前不動(dòng)桿菌中已發(fā)現(xiàn)的有OXA-23、OXA-4、OXA-25、OXA-26、OXA-27、OXA-40。OXA-23對(duì)苯唑西林具有很強(qiáng)的水解活性，但對(duì)氨芐西林卻相對(duì)較弱，而OXA-27對(duì)這類抗菌藥物都只具有弱的水解活性。它們的活性不能被克拉維酸完全抑制，可被氯離子強(qiáng)烈抑制。此外，OXA-23的保守序列的點(diǎn)突變也與它對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥有關(guān)^[7]。

本研究中未檢出VIM、IMP和OXA-24基因,但有95%的菌株經(jīng)PCR產(chǎn)物電泳和測(cè)序證實(shí)產(chǎn)OXA-23型碳青霉烯酶，而OXA-23陰性的1株菌株經(jīng)多次檢測(cè)MIC值均為臨界值（16 ug/ml）。本組菌對(duì)亞胺培南的高耐藥率和高M(jìn)IC值，可能還與其他耐藥機(jī)制參與有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)OXA-24對(duì)亞胺培南、米諾配能等碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，分子克隆發(fā)現(xiàn)這類細(xì)菌染色體上編碼碳青霉烯類抗菌藥物水解酶，同時(shí)伴有22 kd和33 kd的外膜孔蛋白的低表達(dá)和抗生素靶位的改變^[8]。

隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥現(xiàn)狀日趨嚴(yán)重，加強(qiáng)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性監(jiān)測(cè)、進(jìn)一步深入研究細(xì)菌的耐藥機(jī)制,從預(yù)防耐藥性和控制感染角度出發(fā)不斷研制和開發(fā)新的抗菌藥物和非抗生素類抗菌藥物,將成為今后的工作重點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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