直腸癌組織ｕＰＡ系統(tǒng)和ＶＥＧＦ表達(dá)與浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系

閆春生　戰(zhàn)學(xué)雷

【摘要】 目的 研究尿激酶型纖溶酶原激活系統(tǒng)uPA,uPAR,PAI-1蛋白及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在直腸癌組織中的表達(dá)及其與直腸癌癌生物學(xué)行為的關(guān)系。方法 2005年1月至2006年1月，采用免疫組化S-P法檢測67例直腸癌及癌旁組織中uPA,uPAR,PAI-1及VEGF蛋白表達(dá)情況，同時對臨床病理學(xué)資料進(jìn)行回顧性分析。結(jié)果 癌和癌周比較uPA,uPAR,PAI-1及VEGF蛋白陽性表達(dá)率明顯升高(P<0.01)，陽性產(chǎn)物主要分布在癌細(xì)胞胞質(zhì)。侵及漿膜組陽性率明顯高于未及漿膜組(P=0.000,0.014,0.016,0.000)。uPA,uPAR蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P=0.002,0.008)。PAI-1蛋白在低分化組中的陽性率明顯低于中分化和高分化組(P<0.05)。uPA,uPAR及VEGF蛋白陽性率在直腸癌組織不同分化程度間差異無顯著性。在直腸癌組織中uPA,uPAR蛋白的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.653,P<0.001)。在uPA,uPAR蛋白同時陽性的41例病例中，有28例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與陰性組(4/15)相比，轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯增高(P<0.01)。直腸癌組織中uPA蛋白表達(dá)與VEGF表達(dá)顯著正相關(guān)(r= 0.300,P<0.05)。PAI-1蛋白表達(dá)與VEGF表達(dá)具有極顯著正相關(guān)性(r=0.413,P<0.01)。應(yīng)用COX回歸模型進(jìn)行多變量分析并采用向前逐步回歸法，僅浸潤深度、uPA表達(dá)和病理類型對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有影響。結(jié)論 uPA,uPAR,PAI-1及VEGF蛋白在直腸癌組織中表達(dá)增強(qiáng)，uPA,uPAR與直腸癌浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 直腸癌；uPA系統(tǒng)；血管內(nèi)皮生長因子；浸潤；轉(zhuǎn)移；免疫組化

Expression of urokinase-type plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in rectal cancer and its correlation with invasion and metastasis

YAN Chun-sheng,ZHAN Xue-lei.Department of Surgery,Tonghe Peoples Hospital,Heilongjiang 150900，China

【Abstract】 Objective To detect the expression of urokinase-type plasminogen activator (uPA),uPA receptor (uPAR),plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in rectal cancer (RC) and to reveal their correlation to the major clinicopathological characteristics including tumor invasion and metastasis.Methods Expression of uPA,uPAR,PAI-1 and VEGF was examined in the tissue sections from 67 cases of RC using streptoavidin-biotin-peroxidase immunohistochemistry method.Results The expression of uPA,uPAR,PAI-1 and VEGF was mainly located in the cytoplasm of RC cells.The expression of uPA,uPAR,PAI-1 and VEGF in RC was significantly higher than in the cancer-adjacent tissue (P<0.01).The expression of uPA,uPAR,PAI-1 and VEGF in RC with serosa invasion was significantly higher than that in cancer without serosa invasion (P<0.05).Positive rates of staining for uPA and uPAR in GC with lymph node metastasis were significantly higher compared to cancer without lymph node metastasis (P=0.002 and 0.008 respectively).The expression of PAI-1 was significantly associated with the differentiation degree of cancer (P<0.01),while no relationship was found between the expression of uPA,uPAR,VEGF and the differentiation degree of cancer.The expression of uPA was correlated with uPAR in cancer tissue(r=0.653,P<0.001).In 41 cases positive for uPA and uPAR,28 were with lymph node metastasis (P<0.01,compared with 4/15).Positive correlation was observed between the expression of uPA and VEGF protein (r=0.300,P<0.05),and between PAI-1 and VEGF (r=0.413,P<0.01).Multivariate Cox regression analysis indicated that only the depth of invasion,the expression of uPA and the differentiation affected lymph node metastasis in RC.Conclusion Expression of uPA,uPAR,PAI-1 and VEGF protein is increased in RC.uPA and uPAR may play an important role in the invasion and metastasis through VEGF which promotes angiogenesis.

【Key words】 Urokinase-type activator system;Vascular endothelial growth factor； Rectal cancer；Invasion；Metastasis；Iimmunohistochemistry

尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是一種蛋白水解酶，其介導(dǎo)的纖維蛋白降解作用能破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用［1-2］。腫瘤誘導(dǎo)的血管生成反應(yīng)亦與其生物學(xué)行為密切相關(guān)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被認(rèn)為是作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生成調(diào)控因子［3］。筆者采用免疫組織化學(xué)方法檢測67例直腸癌組織中uPA,uPAR,PAI-1及VEGF的表達(dá)，探討其與直腸癌生物學(xué)行為的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院2005年1月至2008年1月直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本67例，術(shù)前未接受過抗腫瘤治療。男54例,女13例,年齡34~78歲。所有病例均經(jīng)病理診斷證實(shí)。其中潰瘍型37例(55.2%),腫塊型5例(7.5%),浸潤型25例(37.3%)；腺瘤癌變4例(5.9%)，高分化腺癌20例(29.9%),中分化腺癌26例(38.8%)，粘液腺癌14例(20.9%)，印戒細(xì)胞癌3例(4.5%)。Dukes A期3例(4.5%)，B期55例(82.1%)，C期8例(11.9%)，D期1例(1.5%)。以癌旁組織為對照。所有標(biāo)本組織經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 方法 采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P)方法。兔抗人uPA蛋白多克隆抗體(BA0405)、兔抗人uPAR蛋白多克隆抗體(BA1368)、兔抗人PAI-1蛋白多克隆抗體(BA1334)均購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，工作濃度分別為1∶50，1∶100，1∶100。VEGF多克隆抗體、免疫組化S-P試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)公司，VEGF工作濃度為1∶50。每批染色均用已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照.染色結(jié)果判斷分別按陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度計分。陽性細(xì)胞數(shù)為0，計0分；1%~25%計1分；26%~50%計2分；>50%計3分。染色陰性計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。兩種積分相加，積分為0~2分，表示陰性(-)；積分為3~4分，表示陽性(+)；積分為5~6分，表示陽性(++)。+、++均視為陽性表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 uPA，uPAR，PAI-1蛋白的表達(dá) uPA，uPAR蛋白的陽性產(chǎn)物主要位于直腸癌細(xì)胞的胞質(zhì)中，強(qiáng)度深淺不一。腫瘤內(nèi)少量成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞可見較弱的陽性表達(dá)。PAI-1蛋白的陽性產(chǎn)物也主要定位于直腸癌細(xì)胞的胞質(zhì)中，但與分化程度有關(guān)：在分化高的直腸癌組織，腫瘤細(xì)胞呈彌漫性胞質(zhì)著色；隨著分化程度降低，染色有加深趨勢，部分胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色顆粒。上述三種蛋白在癌旁組織都有不同程度的陽性表達(dá)。正常直腸黏膜上皮多呈陰性表達(dá)。VEGF蛋白陽性信號主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)，其表達(dá)呈明顯異質(zhì)性，在低分化癌和印戒細(xì)胞癌中的表達(dá)多呈強(qiáng)陽性，一些血管內(nèi)皮細(xì)胞也可見弱的VEGF表達(dá)。在癌旁組織中，大部分腺上皮呈陰性表達(dá)。直腸癌組織中uPA，uPAR，PAI-1，VEGF蛋白的陽性表達(dá)率分別為68.7%，68.7%，70.1%和76.2%，明顯高于他們在癌旁組織中的陽性表達(dá)，分別為28.4%，31.3%，40.3%和20.9%，差異具有顯著性意義(P<0.01)。

2.2 uPA，uPAR，PAI-1，VEGF蛋白表達(dá)和臨床病理因素的關(guān)系 uPA，uPAR，PAI-1，VEGF蛋白在侵及漿膜組中的陽性表達(dá)率明顯高于未及漿膜組，差異具有顯著性意義(表1)。uPA，uPAR蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異具有顯著性意義。PAI-1蛋白在低分化組中的陽性率明顯低于中分化和高分化組，差異有顯著性(P<0.05)。uPA，uPAR，VEGF蛋白陽性率在不同分化程度間差異無顯著性。在直腸癌組織中uPA與uPAR蛋白的表達(dá)具有極顯著正相關(guān)性(r=0.653,P<0.001)。在uPA，uPAR蛋白同時陽性的41例病例中，有28例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與陰性組(4/15)相比，轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯增高(P<0.01)。

2.3 uPA，uPAR，PAI-1與VEGF蛋白表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性 直腸癌組織中uPA蛋白表達(dá)與VEGF蛋白表達(dá)顯著正相關(guān)(r=0.300,P=0.014<0.05)。PAI-1蛋白的表達(dá)與VEGF蛋白表達(dá)具有極顯著正相關(guān)性(r=0.413,P=0.001<0.01)。uPAR與VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.206,P=0.095)。應(yīng)用COX回歸模型進(jìn)行多變量分析并采用向前逐步回歸法，得出在諸多臨床病理因素以及uPA,uPAR,PAI-1和VEGF蛋白等指標(biāo)中，僅浸潤深度、uPA表達(dá)和病理類型被引進(jìn)方程，對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有影響(表2)。

3 討論

uPA介導(dǎo)的纖溶酶降解系統(tǒng)在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。uPA是一種絲氨酸蛋白酶，由多種腫瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞分泌，通過與細(xì)胞膜上的特異性受體uPAR結(jié)合發(fā)揮作用，激活纖溶酶原成為纖溶酶。另外，uPA還激活潛在活性的膠原酶，與纖溶酶一起均促使細(xì)胞外基質(zhì)(包括層粘連蛋白、纖維連接蛋白、蛋白多糖和Ⅳ型膠原等)和血管基膜的降解，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移［4］。uPA的活性被他的特異性抑制劑PAI-1所調(diào)控。本研究的結(jié)果顯示uPA，uPAR，PAI-1蛋白主要定位于直腸癌組織中的癌細(xì)胞胞質(zhì)，腫瘤內(nèi)少量成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞可見較弱的uPA，uPAR蛋白陽性表達(dá)。uPA，uPAR，PAI-1蛋白在直腸癌組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯增高(P<0.01)，表明隨著細(xì)胞惡性程度的增高，uPA，uPAR，PAI-1蛋白表達(dá)呈增高趨勢。其他學(xué)者利用ELISA和免疫組織化學(xué)方法檢測uPA，uPAR蛋白表達(dá)水平時，亦發(fā)現(xiàn)癌中心、癌邊緣和正常組織中uPA、uPAR、PAI-1蛋白活性逐漸降低［5-6］，與本結(jié)果基本一致。筆者還發(fā)現(xiàn)uPA，uPAR蛋白在侵及漿膜組中的陽性表達(dá)率明顯高于未及漿膜組(P<0.05)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.01)，差異均具有顯著性意義，進(jìn)一步證實(shí)了uPA/uPAR系統(tǒng)參與了直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，這可能是因為高表達(dá)uPA和uPAR蛋白的癌細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分的能力增強(qiáng)，使這部分細(xì)胞更易向組織深層和淋巴管浸潤，并導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，在直腸癌組織中uPA和uPAR蛋白的表達(dá)存在顯著的正相關(guān)(r= 0.653,P<0.001)，提示在直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中，對細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解作用是二者共同作用的結(jié)果。在uPA，uPAR蛋白同時陽性的41例病例中，有28例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與陰性組(4/15)相比，轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯增高(P<0.01)，提示在直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中，uPA，uPAR協(xié)同高表達(dá)時，腫瘤細(xì)胞可能具有更高的移動性和侵襲力。最近的研究表明，uPA和uPAR結(jié)合后可促進(jìn)整合素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)作用，而這一信號傳導(dǎo)作用又進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［7-8］。目前有關(guān)PAI-1在腫瘤生物學(xué)中的確切作用還不清楚，他在纖溶酶原激活系統(tǒng)中可能擔(dān)當(dāng)重要的調(diào)節(jié)劑或者是腫瘤細(xì)胞防止自身降解的保護(hù)劑而不是這個系統(tǒng)單純的抑制劑［9］。也有學(xué)者認(rèn)為，PAI-1在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中與uPA，uPAR有協(xié)同和調(diào)節(jié)作用。

VEGF是一類作用最強(qiáng)、特異性最高的可溶性血管生成促進(jìn)因子，他與內(nèi)皮細(xì)胞上的兩個特殊受體flt和flk(kDk)結(jié)合，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生，在腫瘤血管發(fā)生中起著重要作用。在腫瘤血管的生成過程中，腫瘤也完成了擴(kuò)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，故VEGF與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等特性密切相關(guān)［10-11］。本結(jié)果表明，VEGF蛋白主要表達(dá)于直腸癌細(xì)胞的胞質(zhì)中，一些血管內(nèi)皮細(xì)胞也可見弱表達(dá)。VEGF在直腸癌組織中的陽性表達(dá)(76.1%)明顯高于癌旁組織(20.9%)(P<0.01)，VEGF的表達(dá)還與腫瘤浸潤深度呈明顯正相關(guān)(P<0.01)。說明VEGF的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞的惡性表型有一定的作用，隨著腫瘤惡性程度的增高以及侵襲性的增強(qiáng)，癌細(xì)胞必須通過增加VEGF等促血管生成因子的分泌來刺激血管新生，以滿足其自身營養(yǎng)需求。腫瘤新生血管形成與ECM降解是惡性腫瘤生長、浸潤轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵因素。uPA系統(tǒng)在腫瘤新生血管形成過程中起重要作用。VEGF可直接刺激腫瘤新生血管形成，并上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)uPA，uPA也能直接激活VEGF［12］。VEGF與uPA系統(tǒng)相互作用，形成正反饋調(diào)節(jié)環(huán)，極大增加uPA產(chǎn)物，降解ECM及微血管基底膜，為內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增生以及腫瘤新生血管形成有利的微環(huán)境，同時也有利于癌細(xì)胞脫落進(jìn)入血管或向鄰近組織擴(kuò)散，為腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。而PAI-1對腫瘤新生血管形成的調(diào)節(jié)主要包括兩方面：首先PAI-1抑制uPA活性，防止過分的ECM降解，適度的ECM降解則是內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增生所必需。其次，PAI-1與uPAR，F(xiàn)N，VN及整合素等相互作用，通過復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、增生和分化，促進(jìn)腫瘤血管的發(fā)生、形成［13-14］。本結(jié)果顯示，直腸癌組織中uPA，PAI-1蛋白表達(dá)與VEGF蛋白表達(dá)顯著正相關(guān)(P<0.01)，說明uPA系統(tǒng)與VEGF在直腸癌的血管生成中可能起著協(xié)同作用，他們在直腸癌的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，uPA在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用可能部分由于其對血管生成的作用。因此，采用uPA拮抗劑及血管生成抑制劑可能會抑制直腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ Konno H,Abe J,Kaneko T,et al.Urokinase receptor and vascular endothelial growth factor are synergistically associated with the liver metastasis of colorectal cancer.Jpn J Cancer Res,2001，92:516-523.

［2］ Li P,Gao Y,Ji Z,et al.Role of urokinase plasminogen activator and its receptor in metastasis and invasion of neuroblastoma.J Pediatr Surg，2004，39:1512-1519.

［3］ Ribatti D.The crucial role of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor in angiogenesis:a historical review.Br J Haematol,2005，128:303-309.

［4］ ndreasen PA,Egelund R,Petersen HH.The plasminogen activation system in tumor growth,invasion,and metastasis.Cell Mol Life Sci,2000，57:25-40.

［5］ Cho JY,Chung HC,Noh SH,et al.High level of urokinase-type plasminogen activator is a new prognostic marker in patients with gastric carcinoma.Cancer,1997，79:878-883.

［6］ Okusa Y,Ichikura T,Mochizuki H.Prognostic impact of stromal cell-derived urokinase-type plasminogen activator in gastric carcinoma.Cancer,1999，85:1033-1038.

［7］ Yebra M,Goretzki L,Pfeifer M,Mueller BM.Urokinase-type plasminogen activator binding to its receptor stimulates tumor cell migration by enhancing integrin-mediated signal transduction.Exp Cell Res,1999，250:231-240.

［8］ Kugler MC,Wei Y,Chapman HA.Urokinase receptor and integrin interactions.Curr Pharm Des,2003，9:1565-1574.

［9］ Schmitt M,Harbeck N,Thomssen C,et al.Clinical impact of the plasminogen activation system in tumor invasion and metastasis:prognostic relevance and target for therapy.Thromb Haemost,1997，78:285-296.

［10］ Maeda K,Chung YS,Ogawa Y,et al.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma.Cancer,1996，77:858-863.

［11］ Kimura H,Konishi K,Nukui T,et al.Prognostic significance of expression of thymidine phosphorylase and vascular endothelial growth factor in human gastric carcinoma.J Surg Oncol,2001，76:31-36.

［12］ Cavallaro U,Tenan M,Castelli V,et al.Response of bovine endothelial cells to FGF-2 and VEGF is dependent on their site of origin:Relevance to the regulation of angiogenesis.J Cell Biochem,2001，82:619-633.

［13］ Isogai C,Laug WE,Shimada H,et al.Plasminogen activator inhibitor-1 promotes angiogenesis by stimulating endothelial cell migration toward fibronectin.Cancer Res,2001，61:5587-5594.

［14］ Reuning U,Magdolen V,Hapke S,et al.Molecular and functional interdependence of the urokinase-type plasminogen activator system with integrins.Biol Chem,2003，384:1119-1131.