結(jié)腸癌患者Ｗｎｔ信號(hào)通路的變化和作用

陳伙輝　汪森明　陳燕武　陳廣幸　吳鳳堅(jiān)　張　健

【摘要】 目的 探討結(jié)腸癌患者Wnt信號(hào)通路的變化情況及其作用意義。方法 利用Human Genome U133 Plus 2.0基因芯片對(duì)結(jié)腸正常黏膜組織和癌組織基因表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)，分析Wnt信號(hào)通路基因表達(dá)變化情況。 結(jié)果 Wnt信號(hào)通路中FRP、Frizzled、CK2、p53、PP2A、CKIα、JNK、CaMKII、CaN、c-jun、cyc-D等關(guān)鍵基因均呈下調(diào)，調(diào)控著細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄等。結(jié)論 Wnt信號(hào)通路可能是調(diào)控結(jié)腸癌演變過(guò)程的重要信號(hào)通路之一。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)腸癌; Wnt信號(hào)通路; 基因芯片お

The changes and and roles of Wnt signaling pathway in colon cancer patients

CHEN Di-hui,WANG Shen-ming,CHEN Yan-wu.

The Second Peoples Hospital of Zhaoqing, Guangdong 526020, China

【Abstract】 Objective To study the changes and roles of Wnt signaling pathway in colon cancer patients.Methods The Human Genome U133 Plus 2.0 Array were used to analyze gene expression profiles in colon cancer and normal tissues.The genes related to Wnt signaling pathway were selected through genechip data analyasis.Results The key genes related to Wnt signaling pathway of FRP, Frizzled, CK2, p53, PP2A, CKIα, JNK, CaMKII, CaN, c-jun, cyc-D were down regulation, which controled the cell cycle and gene transcription of the vascular endothelial cell. Conclusion Wnt signaling pathway may be one of the most important pathway to control the development of colon cancer.

【Key words】 Colon cancer; Wnt signaling pathway; Genechip

結(jié)腸癌是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，早期癥狀不明顯，無(wú)特異性，晚期表現(xiàn)為大便習(xí)慣改變，早期診斷、有效地判斷病情的發(fā)展、評(píng)估預(yù)后對(duì)降低結(jié)腸癌病死率十分重要。而進(jìn)一步深入研究結(jié)腸癌發(fā)生機(jī)制，是更好防治結(jié)腸癌的必要基礎(chǔ)。近年研究發(fā)現(xiàn)Wnt(果蠅無(wú)翅基因wingless與小鼠基因Int-1的縮合)信號(hào)途徑調(diào)節(jié)控制著許多生命過(guò)程，參與細(xì)胞的癌變、增殖、分化、凋亡等^[1-2]。Wnt信號(hào)通路與結(jié)腸癌之間的關(guān)系研究有待進(jìn)一步深入探討。本實(shí)驗(yàn)旨在探討Wnt信號(hào)通路與結(jié)腸癌形成的部分分子作用機(jī)制，以期為結(jié)腸癌的臨床防治提供一種新的方法。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本與分組 所有病例標(biāo)本均取自肇慶市第二人民醫(yī)院內(nèi)窺鏡室纖維結(jié)腸鏡摘除活檢標(biāo)本，所有標(biāo)本均得到患者的知情同意，所有患者檢查前均未接受化療、放療或其他針對(duì)腫瘤的治療。所取標(biāo)本一部分在離體后60 s內(nèi)迅速放入凍存管，置入液氮罐保存。其余所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)觀察證實(shí)。根據(jù)病檢結(jié)果分為正常組織組（A組）和結(jié)腸癌組（B組），每組各納入3例標(biāo)本。

1.2 基因表達(dá)譜芯片檢測(cè) TRIzol一步法提取上述2組標(biāo)本總RNA，并進(jìn)行純化和質(zhì)檢。以各組總RNA為模板合成雙鏈cDNA；體外轉(zhuǎn)錄生成生物素標(biāo)記的cRNA;純化和片段化處理后，取10 μg cRNA與Human Genome U133 Plus 2.0 Array進(jìn)行雜交、洗脫、染色掃描檢測(cè)信號(hào)。

1.3 芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)分析 采用Affymetrix掃描儀進(jìn)行掃描。差異表達(dá)基因的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：change為I，Ratio≥1，實(shí)驗(yàn)組Detection為P的為上調(diào)基因；change為D，Ratio≤－1，對(duì)照組Detection為P的為下調(diào)基因。

1.4 pathway查詢分析 通過(guò)kegg pathway database (www.genome.jp/kegg/)查詢B vs A的差異基因參與的pathway信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 股靜脈組織的總RNA提取及電泳圖 各組股靜脈組織總RNA的OD260/OD280介于1.8～2.0之間，行瓊脂糖凝膠電泳，28SRNA和18SRNA條帶整齊，28S與18S的吸光值之比約為2，制備的總RNA樣品合格（圖1）。

2.2 差異基因表達(dá)

2.2.1 概況 見表1。

2.2.2 pathway查詢結(jié)果 主要涉及了Wnt、MAPK、Focal adhension、Toll-like等多個(gè)信號(hào)通路。Wnt信號(hào)通路上游基因FRP；通路下游基因CK2、p53、PKA、PP2A、β-catenin、CKIα、Rac、CaMKII、CaN以及通路末端基因fra-1、cyc-D均呈上調(diào)差異表達(dá)；而Wnt信號(hào)通路上游基因PLC則呈下調(diào)狀態(tài)。圖中是B vs A對(duì)比的差異表達(dá)基因映射入Wnt信號(hào)通路結(jié)果，紅色代表基因表達(dá)上調(diào)，藍(lán)色代表基因表達(dá)下調(diào)（圖2）。

3 討論

結(jié)腸癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，隨著生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)^[3]。在過(guò)去的幾十年，許多新藥和新方法的綜合應(yīng)用使得結(jié)腸癌患者的生存率有了相當(dāng)?shù)奶岣摺５Y(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)仍然是臨床上面臨的主要難題，是治療失敗的主要原因。所以很有必要對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。既往的研究表明結(jié)腸癌的形成是一個(gè)涉及多基因，多系統(tǒng)的疾病^[4,5]。這些基因構(gòu)建成龐大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，影響著腫瘤的演變狀態(tài)。

細(xì)胞外各種刺激通過(guò)相應(yīng)介質(zhì)與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合后誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞增殖分化或周期停滯，構(gòu)成細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。Wnt信號(hào)通路有3條主要分支^[6-9]：①經(jīng)典的Wnt-β-catenin-LEF/TCF通路。這條通路激活后將募集細(xì)胞內(nèi)β-catenin，后者活化轉(zhuǎn)移人細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF等共同作用激活特異基因的轉(zhuǎn)錄；②細(xì)胞極性通路。調(diào)控細(xì)胞骨架的重排；③Wnt/Ca2+通路，通過(guò)鈣依賴性激酶、鈣調(diào)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子NF-AT起作用。β-catenin不能被GSK-3β磷酸化，避免β-catenin經(jīng)泛素一蛋白酶體系統(tǒng)降解，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集，聚集到一定量后轉(zhuǎn)位到胞核中，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞增殖加快、凋亡抵抗。在此系統(tǒng)中，癌基因的激活和抑癌基因的失活刺激細(xì)胞加速增殖與無(wú)限生長(zhǎng)或抑制凋亡，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。有研究表明^[10,11]：Wnt-β-catenin通路調(diào)節(jié)TCF/LEF基因在一些腫瘤中廣泛被過(guò)度激活，例如黑素瘤、肝細(xì)胞癌、毛囊癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤等；對(duì)Wnt通路的組分結(jié)構(gòu)功能以及相互作用的研究，發(fā)現(xiàn)Wnt-β-catenin與TCF的結(jié)合位點(diǎn)與APC、cadherin和Axin不同，可以為分子藥物設(shè)計(jì)提供潛在的靶位，該通路的抑制劑可能成為新的抗癌前體藥物。

本實(shí)驗(yàn)研究之信號(hào)通路顯示，差異表達(dá)之基因均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，有FRP、CK2、p53、PKA、PP2A、β-catenin、CKIα、Rac、CaMKII、CaN、fra-1、cyc-D、PLC等。這些基因通過(guò)網(wǎng)絡(luò)傳遞信息，相互協(xié)調(diào)、相互調(diào)控。FRP為Wnt信號(hào)通路的上游基因，在機(jī)體受到外界的刺激后，呈現(xiàn)下調(diào)抑制狀態(tài)，調(diào)控影響著下游基因，如CK2、p53、PKA、PP2A、β-catenin、CKIα、Rac、CaMKII、CaN等，而這些基因?qū)⒉煌盘?hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的信號(hào)加以整合,起著多種信號(hào)的交匯點(diǎn)或共同通路的作用。末端效應(yīng)基因如fra-1、cyc-D等基因異常表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的細(xì)胞周期和基因轉(zhuǎn)錄等，進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與功能。

本實(shí)驗(yàn)提示：結(jié)腸癌發(fā)生有多個(gè)基因表達(dá)的異常表達(dá)，通過(guò)所編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)與量的改變，使細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控失常，代謝狀態(tài)異常等，最終導(dǎo)致了細(xì)胞的生長(zhǎng)失去正常調(diào)控，向惡性轉(zhuǎn)化。臨床上如干擾其中的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，就有可能預(yù)先中止腫瘤的發(fā)生或者減輕腫瘤的危害程度，從而為臨床結(jié)腸癌的防治提供新的方向和靶點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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