連香樹水提物和乙醇提取物的體外抗氧化研究

楊添雁 沙秀芬 魏琴 李群

摘 要：為了探究連香樹水提物和乙醇提取物的主要成分和抗氧化作用，該研究采用水提和醇提兩種方法提取連香樹葉片中的代謝物并測定其主要成分，通過體外抗氧化實驗，即清除羥自由基（·OH）、DPPH自由基（DPPH·）、超氧陰離子（O2-·）和還原鐵離子（Fe3+）的能力等四個指標來評價其抗氧化作用。結(jié)果表明：連香樹水提物和乙醇提取物中均含有山萘酚。此外，水提物中還含有苜蓿素和異槲皮苷等黃酮類物質(zhì);乙醇提取物中還含有柚皮素和槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷等黃酮類物質(zhì)。水提物和乙醇提取物均有清除羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子及還原三價鐵離子的能力。抗氧化的作用隨提取物濃度的增大而增強，其中清除超氧陰離子（IC50值分別為0.092、0.002 mg·mL-1）的能力強于陽性對照Vc（IC50值為0.241 mg·mL-1）且鐵離子還原力的IC50值（水提物為0.014 mg·mL-1，乙醇提取物為0.001 mg·mL-1）相對較小，說明其總抗氧化活性較強。由此可見，連香樹水提物和乙醇提取物均具有良好的抗氧化作用，可作為一種潛在的天然抗氧化劑。

關(guān)鍵詞：連香樹， 水提物， 乙醇提取物， 抗氧化作用

中圖分類號：Q946

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）11-1512-10

Abstract：In order to study on the main components and antioxidation of Cercidiphyllum japonicum aqueous extract and ethanol extract， the secondary metabolites of C. japonicum leaf were extracted by aqueous extraction and ethanol extraction and the main components of aqueous extract and ethanol extract of C. japonicum were determined. The antioxidant effects of aqueous extract and ethanol extract of C. japonicum were evaluated by in vitro antioxidant assays， such as the ability of scavenging hydroxyl radical （·OH）， the ability of scavenging DPPH free radical （DPPH·）， the ability of scavenging superoxide anion （O2-·） and the ability of reducing iron ion （Fe3+）. The results showed that the main components of the aqueous extract and the ethanol extract of C. japonicum both contain kaempferol. In addition， the main components of the aqueous extract of C. japonicum also contained flavonoids such as alfalfa and isoquercetin， and the main components of the ethanol extract of C. japonicum also contained flavonoids such as naringin and quercetin 3-O- β -dglucoside. The aqueous extract and the ethanol extract of C. japonicum both had the ability of scavenge hydroxyl radicals， DPPH free radicals， superoxide anions and the ability of reducing iron ion. The antioxidant effects of the aqueous extract and the ethanol extract of C. japonicum increased with the increasing concentrations， which was dose-dependent. Speci-fically， the ability of the aqueous extract and the ethanol extract of C. japonicum to scavenge superoxide anion （IC50 values were 0.092 mg·mL-1 and 0.002 mg·mL-1 respectively） was stronger than that of positive control Vc （IC50 value was 0.241 mg·mL-1）. Furthermore， the IC50 value of the aqueous extract and the ethanol extract of C. japonicum on iron ion reducing power was relatively small （the IC50 value of the aqueous extract was 0.014 mg·mL-1; the IC50 value of the ethanol extract was 0.001 mg·mL-1）， which indicated that the total antioxidant activity of C. japonicum extracts were strong. It can be seen that the aqueous extract and the ethanol extract of C. japonicum both have good antioxidant effects， and it can be used as a potential source of natural antioxidants.

Key words：Cercidiphyllum japonicum， aqueous extract， ethanol extract， antioxidant

連香樹（Cercidiphyllum japonicum）別名山白果，是連香樹科連香樹屬的一種古老稀有的落葉大喬木，被國家列為二級保護植物（姚連芳和李宏瀛，2005），主要分布在日本和我國四川西部和東南部、山西南部、湖北西部等海拔400～2 500 m的常綠和落葉闊葉混交林中（黃紹輝，2007）。連香樹其味芳香，百米可聞。樹姿高大雄偉，葉型對稱美觀（郭郢和王安明，2004）。根、莖、葉均可作藥用，特別是樹皮煎水飲服，對治療感冒、痢疾有特殊療效（陳仲平，2005）。樹皮和葉均含有鞣質(zhì)，可提取烤膠（姚連芳和李宏瀛，2005）。因此，連香樹具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟價值。目前對連香樹的研究報道大多是關(guān)于通過組培、快速繁殖（麥苗苗，2006;袁麗潔，2008;陳榮珠等，2012）等方法來恢復(fù)擴大其資源，而連香樹次生代謝產(chǎn)物及其功能開發(fā)等方面的研究還不夠完整，特別是抗氧化、抗癌等方面的研究尤為少見。該文擬對連香樹葉片次生代謝物的主要成分及成分的抗氧化作用情況做一探索。

天然植物抗氧化劑是一類無毒、安全的抗氧化劑，具有重要的生物活性（張澤生等，2017）。它能有效清除機體受到氧化應(yīng)激時產(chǎn)生的過多的自由基，使機體的氧化還原系統(tǒng)處于動態(tài)平衡（溫朋飛和彭艷，2017）。研究表明，傳統(tǒng)合成的抗氧化劑如叔丁基對羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）等本身可能具有潛在毒性，對人體造成危害，所以尋找低毒、安全、高效的天然植物抗氧化劑成為了一種必然趨勢（熊皓平等，2001）。目前，許多植物的提取物均具有良好的抗氧化作用，且不同方法、不同溶劑的提取物其抗氧化作用不同（李海亮等，2017;袁保剛等，2011;潘爭紅等，2016）。該文旨在以連香樹葉片為試材，通過水提和醇提兩種方法獲取提取液并測定其中的主要成分，分別對兩種提取液進行體外測定羥自由基（·OH）、DPPH自由基（DPPH·）和超氧陰離子（O2-·）三種自由基的清除實驗和三價鐵離子（Fe3+）的還原力來研究連香樹葉片提取物的抗氧化作用，為進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集與制備 連香樹（Cercidiphyllum japonicum）：2017年7月中旬采自海拔1 800 m的四川省廣元市旺蒼縣鹽井河采育場，經(jīng)四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬丹煒教授鑒定確認為連香樹（Cercidiphyllum japonicum）。在實驗室將葉子摘取下來后粉碎至粉末，備用。

1.1.2 試劑 硫酸亞鐵（FeSO4），過氧化氫（H2O2， 0.3%），三羥甲基氨基甲烷（Tris），鹽酸（HCl），鄰苯三酚（1，2，3-Trihydroxybenzene），1，1-二苯基-2-苦苯肼自由（1，1-Diphenyl-2-picryhydrazyl， DPPH），鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]，磷酸二氫鈉（NaH2PO4），磷酸氫二鈉（Na2HPO4），氯化鈉（NaCl），三氯乙酸（TCA），氯化鐵（FeCl3），抗壞血酸（Vc），二甲基亞砜（DMSO），無水乙醇，95%乙醇。

1.1.3 主要儀器 AR224CN電子天平，上海奧賽斯儀器有限公司;XH-300A祥皓電腦超聲波組合合成/萃取儀，北京祥皓科技發(fā)展有限公司;RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司;CHASHB-3A循環(huán)水式多用真空泵，北京恒奧德科技有限公司;HH-4恒溫水浴鍋，江蘇金城國勝實驗儀器廠;TGL-16B離心機，上海安亭科技儀器廠;多功能細胞分析儀（MD/Spectra Max M2）;老本行400Y粉碎機;色質(zhì)聯(lián)用儀（Waters XevoG2-XS Tof）。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

1.2.1.1 連香樹水提物的制備 水煎法（史文青等，2012），稱取1 150 g連香樹葉粉末，加入蒸餾水3 200 mL（1∶3），浸泡8 h后文火煎煮4 h，過濾得水提取液500 mL，得率為15.62%。

1.2.1.2 連香樹乙醇提取物的制備 參照焦勝敏（2014）和唐軍等（2011）的方法并略做改進，稱取煮過后的連香樹葉粉末50 g，加入300 mL 80%乙醇（料液比1∶6），溫度60 ℃，超聲波功率為302 W，超聲時間30 min。按上述方法重復(fù)5次后合并提取液過濾，轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得浸膏20 g，得率為8%。

1.2.2 連香樹水提物和乙醇提取物成分的測定 采用超高壓液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀（UPLC-TOF/MS）聯(lián)用技術(shù)對連香樹水提物和連香樹乙醇提取物進行成分分析。色譜和質(zhì)譜條件參照孫國東等（2017a）的實驗方法，質(zhì)量掃描范圍0～800 m/z，數(shù)據(jù)采集時間42 min。

1.2.3 抗氧化作用測定

1.2.3.1 羥自由基（·OH）清除能力 用蒸餾水配制質(zhì)量終濃度為1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 mg·mL-1的連香樹水提物和0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 mg·mL-1的Vc陽性對照溶液;用DMSO配制質(zhì)量終濃度為0.16、0.08、0.04、0.02、0.01 mg·mL-1的連香樹乙醇提取物。參照任秋蓉等（2017）的水楊酸法測定連香樹提取物對羥自由基（·OH） 的清除作用。

1.2.3.2 DPPH自由基清除能力 用蒸餾水配制質(zhì)量終濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·mL-1的連香樹水提物和0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 mg·mL-1的Vc陽性對照溶液;用DMSO配制質(zhì)量終濃度為0.08、0.04、0.02、0.01、0.005 mg·mL-1的連香樹乙醇提取物。參照Li et al（2012）和任秋蓉等（2017）文獻中的DPPH法測定連香樹提取物對DPPH自由基（DPPH·）的清除作用。

1.2.3.3 超氧陰離子（O2-·）清除能力 用蒸餾水配制質(zhì)量終濃度為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg·mL-1的連香樹水提物和3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg·mL-1的Vc陽性對照溶液;用DMSO配制質(zhì)量終濃度為0.008、0.004、0.002、0.001、0.005 mg·mL-1的連香樹乙醇提取物。按照任秋蓉等（2017）文獻中的鄰苯三酚法測定連香樹提取物對超氧陰離子（O2-·）的清除作用。

1.2.3.4 鐵離子（Fe3+）還原力 連香樹水提物、Vc陽性對照溶液和連香樹乙醇提取物對照1.2.3.2的配制方法。參照戚建華等（2012）的方法測定連香樹提取物對鐵離子（Fe3+）的還原力，吸光度值越大，表示樣品液的還原能力越強。

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0處理數(shù)據(jù)， LSD法分析顯著性差異，雙變量法分析相關(guān)性，Probit 法分析 IC50值，使用Microsoft Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 連香樹水提物和乙醇提取物成分分析

連香樹水提物和乙醇提取物經(jīng)UPLC-MS測定后得兩種樣品的總離子流圖和紫外圖，分別見圖1和圖2。在連香樹水提物的總離子流圖中，逐一分析了紫外吸收峰較強的物質(zhì)，以4.37 min處的紫外吸收峰為例， 該時間的分子量為 286.106 9。在二級質(zhì)譜中，生成的一系列碎片離子中含有153? [M+H-C8H6O2]+，與孫國東等（2017b）文獻中報道的山萘酚的二級碎片離子一致，因此推測該物質(zhì)為3，5，7，4-四羥基黃酮即山萘酚，分子式為C15H10O6。同理，還分析出水提物中含有苜蓿素（王鳳云等，2016）、異槲皮苷（黃輝強等，2009）等黃酮類物質(zhì);在連香樹乙醇提取物的總離子流圖中，以3.754 min處的紫外吸收峰為例，也發(fā)現(xiàn)了分子量為286.103 2的化合物。在二級質(zhì)譜中，根據(jù)孫國東等（2017b）文獻中報道的山萘酚的二級碎片進行比對，發(fā)現(xiàn)了有5個相同的主要二級碎片離子，分別是287? [M+H]+， 241? [M+H-CO-H2O]+， 213? [M+H-2CO-H2O]+，165? [M+H- C7H6O2]+，153? [M+H-C8H6O2]+，可確認該物質(zhì)為山萘酚。同理，還分析出了柚皮素和槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷等黃酮類物質(zhì)（孫國東等，2017b）。

2.2 連香樹提取物對羥自由基（·OH）的清除作用

連香樹提取物對羥自由基（·OH）的清除作用見圖3、圖4和表1。從圖3和圖4可以看出，隨著濃度的逐漸減小，反應(yīng)物顏色逐漸變深，表明兩種提取物均有清除羥自由基的作用。由表1可知，連香樹水提物、Vc及乙醇提取物對羥自由基（·OH）的清除率隨濃度增大而增大。在低濃度時，羥自由基（·OH）的清除率僅有6.46%～16.88%的清除率，在高濃度時達到了70%，最高為89.11%，表明幾種物質(zhì)對羥自由基（·OH）的清除率呈濃度依賴性。經(jīng)統(tǒng)計軟件SPSS17.0進一步分析，連香樹水提物的P=0.000，r=0.994;Vc的P=0.026，r=0.921;乙醇提取物的P=0.002，r=0.985，進一步說明連香樹提取物的濃度與羥自由基（·OH）的清除率均呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系。

2.3 連香樹提取物對DPPH自由基（DPPH·）的清除作用

連香樹提取物對DPPH自由基（DPPH·）的清除作用如圖5、圖6和表2所示。從圖5和圖6可以看出，隨濃度增大，反應(yīng)物的顏色由紫色逐漸變?yōu)辄S色，表明二者均有清除DPPH自由基的作用。由表2可知，連香樹水提物、Vc和連香樹乙醇提取物對DPPH自由基（DPPH·）的清除率呈劑量依賴性。在低濃度時，三者對DPPH自由基（DPPH·）的清除率在5.53%～12.15%之間，在高濃度時均達到90%。經(jīng)統(tǒng)計軟件SPSS17.0進一步分析，連香樹水提物的P=0.040，r=0.895;Vc的P=0.013，r=0.950;乙醇提取物的P=0.016，r=0.944。三者的濃度與DPPH自由基（DPPH·）的清除率均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。

2.4 連香樹提取物對超氧陰離子（O2-·）的清除作用

連香樹提取物對超氧陰離子（O2-·）的清除作用見圖7、圖8和表3。從圖7和圖8可以看出，隨著濃度的增大，各濃度之間無明顯顏色變化。但由表3可知，連香樹水提物、Vc和乙醇提取物均有清除超氧陰離子（O2-·）的作用，清除率隨濃度的增大而增大。當達到最高濃度時，三者的清除率在77.21%～87.48%范圍內(nèi)。經(jīng)統(tǒng)計軟件SPSS17.0進一步分析得連香樹水提物的P=0.103，r=0.802，說明連香樹水提物濃度與超氧陰離子（O2-·）的清除率呈正相關(guān)關(guān)系;連香樹乙醇提取物的P=0.040，r=0.895;Vc的P=0.013，r=0.952，表明二者的濃度與超氧陰離子（O2-·）的清除率均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。

2.5 連香樹提取物對鐵離子（Fe3+）的還原力

連香樹提取物對鐵離子（Fe3+）的還原力結(jié)果如圖9、圖10和表4。其中，圖9和圖10分別為連香樹水提物和乙醇提取物鐵離子還原力的顏色反應(yīng)圖，濃度從左到右依次減小。從圖9和圖10可以看出，隨濃度增大，呈黃色的三價鐵離子逐漸被還原成綠色，表明二者均有還原三價鐵離子的能力。由表4可知，連香樹提取物的鐵離子（Fe3+）還原力呈劑量依賴性增加。低濃度時三者的還原力在0.017～0.066之間，高濃度時在0.235～0.397之間。經(jīng)統(tǒng)計軟件SPSS17.0進一步分析，連香樹水提物的P=0.000 0，r=0.997;連香樹乙醇提取物的P=0.000 0，r=0.997;Vc的P=0.000 0，r=0.999。三者的濃度與鐵離子還原力均表現(xiàn)為極顯著的正相關(guān)關(guān)系。

2.6 連香樹水提物、乙醇提取物和Vc抗氧化作用的比較

經(jīng)統(tǒng)計軟件SPSS17.0分析，連香樹水提物、乙醇提取物和Vc的抗氧化作用四個指標的IC50值見表5。由表5可知，連香樹水提物和乙醇提取物的四個抗氧化指標分別與陽性Vc相比，清除羥自由基、DPPH自由基和還原鐵離子的能力均弱于Vc，而清除超氧陰離子的作用強于Vc。經(jīng)方差齊性檢驗后得兩個實驗組和陽性對照組的四個抗氧化指標的P值依次為0.827，0.958，0.052，0.417，均大于0.05，表明方差齊。進一步通過 LSD 單因素方差分析兩個實驗組與陽性對照組的清除率后可得四個抗氧化指標的P值分別為0.802，0.914，0.783，0.565，均大于0.05，說明連香樹水提物組、乙醇提取物組和陽性對照組之間均無顯著差異。

3 討論與結(jié)論

本研究通過UPLC-TOF/MS技術(shù)，從連香樹水提物和乙醇提取物中分別測定出三個黃酮類物質(zhì)，即山萘酚、苜蓿素、異槲皮苷和山萘酚、柚皮素、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷，其中山萘酚這個黃酮類物質(zhì)是兩者共有的成分。這個共有成分在連香樹樹皮的乙醇浸膏中（王靜榮等，1999）也被鑒定，表明山萘酚是連香樹提取物的主要成分。無論是植物精油（權(quán)美平等，2016）、植物水提物（曹曉虹等，2015）還是乙醇提取物（車金鑫等，2017;唐靜月等，2017），其中主要的抗氧化物質(zhì)大致為黃酮類、酚類、萜烯類和含氮化合物。本研究表明連香樹水提物和乙醇提取物均具有抗氧化作用，可能是其提取物中多種黃酮類化合物共同作用的結(jié)果。

連香樹所含化學(xué)成分豐富，其次生代謝產(chǎn)物的功能方面也具有重要的科研價值。本研究提取了連香樹葉片中的次生代謝物，通過體外抗氧化實驗研究其抗氧化作用，結(jié)果表明連香樹提取物能有效清除羥自由基（·OH）、DPPH自由基（DPPH·）、超氧陰離子（O2-·）和還原三價鐵離子（Fe3+）。和陽性對照Vc相比，雖然僅有超氧陰離子（O2-·）的作用強于Vc，但四個抗氧化指標的IC50值與其它天然抗氧化劑（任秋蓉等，2017;潘爭紅等，2016;唐靜月等，2017）相比都相對較小，說明連香樹提取物具有較強的抗氧化作用，可以作為一種潛在的有效的天然抗氧化劑。