甜瓜同源四倍體的創(chuàng)制及其初步定性研究

賈媛媛　張永兵　刁衛(wèi)平　陳勁楓

摘要：通過(guò)未成熟胚子葉的組織培養(yǎng)創(chuàng)造體細(xì)胞無(wú)性系變異，誘導(dǎo)出了齊甜1號(hào)的同源四倍體甜瓜，激素質(zhì)量濃度以BA3.0mg/L為佳，加倍率為14.3％。對(duì)再生的同源四倍體及二倍體甜瓜植株進(jìn)行了莖、葉、花、果實(shí)、種子的形態(tài)觀察，及各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)和主要品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果表明：除果形指數(shù)變小外，四倍體植株的莖、葉、花、果實(shí)、種子各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)的值均顯著大于二倍體。同時(shí)，四倍體甜瓜維生素C、可溶性糖含量也顯著高于二倍體。

關(guān)鍵詞：甜瓜；未成熟胚子葉；同源四倍體；形態(tài)；品質(zhì)

同源多倍體是遺傳和育種研究的重要材料。多倍體的“巨型性”及次生代謝產(chǎn)物增加和抗逆性增強(qiáng)的特性可被用來(lái)改善植物農(nóng)藝性狀、增加產(chǎn)量、改善品質(zhì)。多倍體育種可創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，擴(kuò)大種質(zhì)資源的利用范圍，通過(guò)多倍體誘變、遠(yuǎn)緣雜交等使野生種與栽培種的優(yōu)良性狀相結(jié)合，產(chǎn)生并固定雜種優(yōu)勢(shì)。

在植物多倍體誘導(dǎo)中，利用組織培養(yǎng)過(guò)程中的無(wú)性系體細(xì)胞變異出現(xiàn)自然加倍獲得四倍體再生植株具有成功率高、可一定程度避免嵌合體的產(chǎn)生及條件易調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)。本文通過(guò)未成熟子葉培養(yǎng)過(guò)程篩選鑒定同源四倍體甜瓜，建立同源四倍體誘導(dǎo)體系，并且對(duì)獲得的同源四倍體甜瓜進(jìn)行了形態(tài)觀察和品質(zhì)測(cè)定，為甜瓜多倍體育種實(shí)踐打下了一定的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為早皇后、9904、4810、黃金瓜、齊甜1號(hào)、新青玉，其中早皇后是地方常規(guī)品種，4810為多抗源復(fù)合雜交后的低代自交系，其余4個(gè)為雜交F，代品種。試驗(yàn)于2006年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1未成熟子葉培養(yǎng)從田間摘取發(fā)育18～23d的未成熟果實(shí)，經(jīng)流水沖洗果面后在超凈工作臺(tái)上用75％的酒精進(jìn)行表面消毒。然后剖開(kāi)果實(shí)，取出尚未發(fā)育成熟的種子。去掉種皮并切取近胚軸端子葉中部組織作為外植體，接種在誘導(dǎo)無(wú)性系變異培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基共4種，分別為：MS+BA 1.0mg/L；MS+BA 2.0 mg/L；MS+BA 3.0 mg/L；MS+BA 4.0mg/L。每個(gè)處理接種約20個(gè)外植體，置于弱散射光條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)至葉面或葉緣產(chǎn)生芽叢后，將芽叢及時(shí)切下，轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MS+BA 0.2 mg/ L)上，以促進(jìn)芽伸長(zhǎng)。

除特別說(shuō)明外，所有培養(yǎng)基均為固體培養(yǎng)基，附加3％蔗糖，0.8％瓊脂，pH值5.8左右。培養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃，每日光照16 h，光照度2 000 lx左右。

1.2.2倍性鑒定將馴化后的植株移栽于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜試驗(yàn)基地。植株長(zhǎng)出2-3片真葉后，取長(zhǎng)0.5～1.0 cm的細(xì)嫩卷須，參照陳勁楓等的方法進(jìn)行有絲分裂染色體制片，以確定植株染色體數(shù)目，統(tǒng)計(jì)處理芽數(shù)、愈傷組織數(shù)、出芽數(shù)、變異芽數(shù)和加倍芽數(shù)，計(jì)算出愈率(愈傷組織數(shù)/處理芽數(shù))、出芽率(出芽數(shù)/處理芽數(shù))、變異率(染色體數(shù)目發(fā)生變異的株數(shù)/處理芽數(shù))和加倍率(加倍株數(shù)/處理芽數(shù))。

1.2.3形態(tài)性狀觀察甜瓜進(jìn)入盛花期，測(cè)量植株第3、5、7、9節(jié)的節(jié)間長(zhǎng)、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、葉柄長(zhǎng)、葉柄粗等形態(tài)指標(biāo)；每株分別取5朵當(dāng)天開(kāi)放的雌、雄花，測(cè)量花萼長(zhǎng)、花辦長(zhǎng)和花辦寬。授粉20d后測(cè)果實(shí)縱徑、果實(shí)橫徑、單果質(zhì)量并計(jì)算果形指數(shù)(果實(shí)縱徑/果實(shí)橫徑)。果實(shí)成熟期，采摘四倍體再生植株及二倍體植株果實(shí)5個(gè)，每個(gè)單瓜隨機(jī)選擇20粒種子進(jìn)行觀察、測(cè)量。

1.2.4維生素C及可溶性糖含量的測(cè)定參照李合生的方法，從田間摘取發(fā)育正常的甜瓜果實(shí)，洗凈、擦干，用不銹鋼刀取果肉2g，磨碎后用比色法測(cè)定維生素C含量。同時(shí)，采用蒽酮比色法測(cè)定葉片可溶性糖含量。均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行LSD測(cè)驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1未成熟胚子葉經(jīng)誘導(dǎo)后組織再生情況

白色的未成熟胚子葉外植體(圖版1 A)接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上2～5 d后急速膨大變綠(圖版1B)，切口邊緣形成少量愈傷組織，10～15 d后子葉邊緣或表面開(kāi)始分化出芽叢(圖版1C)或形成愈傷組織塊(圖版1D)。出芽部位多集中在外植體近下胚軸一端切口邊緣與維管束交接處，另一端則較少，30d左右芽長(zhǎng)達(dá)1～2 cm。將芽叢切下轉(zhuǎn)移至伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(圖版1 E)，離體條件下發(fā)生變異的小植株已經(jīng)可以看出其葉片與普通二倍體的不同(圖版1 F)。將所有植株生根后進(jìn)行馴化。

2.2不同質(zhì)量濃度的激素對(duì)甜瓜未成熟胚子葉再生及加倍的影響

試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)不同BA質(zhì)量濃度誘導(dǎo)甜瓜無(wú)性系變異的發(fā)生。表1結(jié)果顯示，BA較高的培養(yǎng)基出愈率也較高，出芽率則相對(duì)較低；相反，BA較低的培養(yǎng)基出愈率較低，出芽率則較高。觀察得到，BA質(zhì)量濃度較高的培養(yǎng)基相對(duì)于較低的培養(yǎng)基，芽叢和愈傷組織塊較為緊實(shí)，分化單芽頻率也較低，而低BA質(zhì)量濃度培養(yǎng)的芽叢和愈傷組織塊則相對(duì)疏松，分化單芽頻率也較高，

不同BA質(zhì)量濃度誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生無(wú)性系變異，成株訓(xùn)化后經(jīng)細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)鑒定，獲得了2n=48的四倍體。各處理的誘導(dǎo)結(jié)果如表l所示。BA質(zhì)量濃度不同對(duì)四倍體出現(xiàn)頻率有較大影響。表1顯示，齊甜1號(hào)以BA 3.0 mg/L最好，加倍率達(dá)到14.3％，而4.0 mg/L時(shí)加倍率僅為6.9％。

2.3再生四倍體植株形態(tài)特征觀察

由表2～4可知，除節(jié)間長(zhǎng)、葉柄長(zhǎng)、萼片長(zhǎng)、果形指數(shù)、單果質(zhì)量外，四倍體植株的莖、葉、花、果實(shí)、種子的大多數(shù)形態(tài)指標(biāo)值顯著大于二倍體，且除雄花、雌花的萼片長(zhǎng)外，二者的差異都達(dá)到了極顯著水平。四倍體的果形指數(shù)為0.78，二倍體為1.68，二者差異極顯著。

根據(jù)田間觀察結(jié)果可知，由于四倍體植株的莖、葉、花外形上具有明顯的巨大性，生長(zhǎng)較為緩慢，葉片肥厚，形狀鈍圓，葉色深綠(圖版2A右)，畸形葉較多，且多發(fā)于植株較低或基部節(jié)位(圖版2 B、C、D)，再生的四倍體植株莖節(jié)變得短粗，分枝力較之二倍體植株差，開(kāi)花期，花器官變大，花辦顏色變深(圖版3)，花辦肥厚，雌蕊和子房增大，且大多數(shù)雌花著生于主蔓莖節(jié)基部，而二倍體植株的雌花則多著生在延伸出的側(cè)蔓上：果形指數(shù)極顯著低于二倍體，果實(shí)較為短粗(圖版4A)；種子增大加厚，呈淡褐色，表面有少許光澤，二倍體種子呈淡黃灰色，表面無(wú)光澤(圖版4B)。

2.4四倍體甜瓜的品質(zhì)變化

表5結(jié)果顯示，四倍體的維生素C與可溶性糖含量都極顯著高于二倍體，其中可溶性糖含量超過(guò)了二倍體的2倍。這表明。四倍體甜瓜在風(fēng)味上有所變化，甜度增加：維生素C含量的增加表明營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也有所增加。

3討論與結(jié)論

植物體細(xì)胞無(wú)性系變異是指植物細(xì)胞經(jīng)組織培養(yǎng)產(chǎn)生的遺傳變異。體細(xì)胞無(wú)性系變異是植物組織培養(yǎng)中的普遍現(xiàn)象。難以預(yù)料的染色體變異給某些作物的改良帶來(lái)了機(jī)會(huì)，也開(kāi)辟了一條染色體加倍的新途徑。

在甜瓜子葉組織培養(yǎng)中，子葉不定芽的分化具有明顯的極性現(xiàn)象。這種極性現(xiàn)象主要表現(xiàn)在不定芽的誘導(dǎo)上?？拷咻S部位的子葉塊不定芽的誘導(dǎo)率高于遠(yuǎn)離胚軸端的子葉塊，而且在每個(gè)了葉塊中也存在這種極性現(xiàn)象，即子葉塊的切口中，靠近胚軸的切口容易產(chǎn)生不定芽，遠(yuǎn)離胚軸的切口則難以形成不定芽。

子葉能否誘導(dǎo)出不定芽有2個(gè)關(guān)鍵因素：一是子葉苗齡，二是激素質(zhì)量濃度。有學(xué)者認(rèn)為，采用未成熟甜瓜子葉進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)有時(shí)間上的優(yōu)勢(shì)。馬國(guó)斌等叫在用不同日齡的甜瓜子葉塊作為外植體時(shí)觀察到叢生芽的誘導(dǎo)率隨著子葉日齡的增長(zhǎng)而下降，這種現(xiàn)象被認(rèn)為是由于此時(shí)細(xì)胞生理上處于“幼態(tài)”，全能性細(xì)胞多的緣故。

本試驗(yàn)對(duì)再生的四倍體及二倍體甜瓜植株進(jìn)行了莖、葉、花、果實(shí)、種子的形態(tài)觀察，及各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)和主要品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果表明，除果形指數(shù)變小外，四倍體植株莖、葉、花、種子各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)的值均顯著大于二倍體，體現(xiàn)出了基因的劑量效應(yīng)。因此，在對(duì)植株進(jìn)行鑒定時(shí)，可以結(jié)合四倍體的形態(tài)特征及生長(zhǎng)緩慢且分枝力差等特點(diǎn)初步篩選變異株，再進(jìn)一步采用染色體制片技術(shù)確定植株倍性，這樣可大大節(jié)約倍性鑒定時(shí)間，減少工作量。本研究還發(fā)現(xiàn)，四倍體甜瓜的維生素C、可溶性糖含量也顯著高于二倍體，說(shuō)明二倍體甜瓜經(jīng)染色體加倍后品質(zhì)得到了改善，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也有所提高。