血栓的藥效研究思路與方法

朱　俊　陽　輝

（江西省婦幼保健院，江西 南昌 330006）お

摘 要：對血栓的形成原因著手，闡述了血栓的藥效研究思路與方法。

關鍵詞：血栓；形成；藥效

中圖分類號：R364.1+5文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）01-0116-02

血栓是指機體血液中，由于血小板凝集或血液凝固等而在心血管內(nèi)形成的固體。血栓癥是一類嚴重危及人類健康及生命的的心血管疾病?，F(xiàn)就其成因及藥效研究闡述如下。

1 血栓形成的原因

19 世紀中期，Virchow^[1]首先提出血栓形成的三大因素：血液高凝、血流滯緩及血管壁損傷，經(jīng)過百年來臨床及多種檢測手段的驗證，Virchow 的理論已得到公認。

1.1 血管高凝

凝血是由系列凝血因子相繼酶解激活，最終生成凝血酶和形成纖維蛋白的復雜過程，即所謂“凝血瀑布”。生理條件下，體內(nèi)還存在與凝血系統(tǒng)相對的抗凝血系統(tǒng)，以保證在少量凝血因子被激活的可能下，不致發(fā)生連鎖凝血正反饋反應。血液中重要的抗凝血因子主要有肝素、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）、蛋白C系統(tǒng)和組織因子途徑抑制物（TFPI）等。血液凝固性增加表現(xiàn)為機體凝血功能亢進或抗凝功能降低，是血栓形成的直接原因之一。

1.2 血流異常

血流是影響血栓形成及其性質(zhì)的重要因素，如在血流緩慢的靜脈所形成的血栓，稱為紅色血栓；而在血流較快的動脈形成的血栓，稱為白色血栓。血流異常主要涉及血液黏度增高和血流方式的異常。

1.3 血管內(nèi)膜受損

生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細胞具有強大的抗血栓形成的功能。正常的血管內(nèi)皮細胞既能生成和釋放使血管松弛的物質(zhì)，如前列環(huán)素（PGI2）和內(nèi)皮松弛因子（EDRF）；又能生成和釋放抑制血小板粘附和聚集的物質(zhì)，如PGI2、EDRF和6-酮-PGE1、13羥十八碳二烯酸；以及多種抗凝血酶的物質(zhì)，如硫酸乙酰肝素、抗凝血酶（AT）、凝血酶調(diào)節(jié)蛋白（TM）和TFPI。此外，血管內(nèi)皮細胞還能合成和分泌組織型纖溶酶原活化劑（t-PA）和尿激酶型纖溶酶原活化劑（u-PA），二者可與纖溶酶的集合在血管內(nèi)皮細胞表面，使纖溶活性增高，以清除正常血液循環(huán)中形成的少量纖維蛋白。此外，血管內(nèi)皮細胞還可產(chǎn)生纖溶酶原活化劑抑制劑（PAI），使已形成的血栓不被溶解，有利于血栓形成^[2]。在炎癥和致動脈粥樣硬化等多種因素的刺激下，血管內(nèi)皮細胞可出現(xiàn)凋亡。凋亡的血管內(nèi)皮細胞不但失去抗血栓形成的功能，還能通過磷脂酰絲氨酸（PS）表達增加失去膜磷脂不對稱性和抗凝膜成分丟失，進而促進血栓形成。內(nèi)皮細胞可因物理、化學、生物、免疫等因素受到損傷，造成功能失衡，結(jié)果使內(nèi)皮細胞的抗栓功能減弱，引起血栓形成。

2 研究思路

根據(jù)血栓形成的三大因素：血液高凝、血流滯緩及血管壁損傷，其藥效研究分為以下三個方面。

2.1 降低血液高凝狀態(tài)

凝血過程按照啟動方式及參與的凝血因子可分為內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑。體內(nèi)抗凝系統(tǒng)大致可分為兩方面：細胞抗凝機制和體液抗凝機制。細胞抗凝機制是單核-巨噬細胞系統(tǒng)對激活的凝血因子、組織因子、凝血酶原復合物及可溶性纖維蛋白的吞噬作用。體液抗凝系統(tǒng)中較重要的有AT-Ⅲ、蛋白C抗凝體系等。

2.2 改變血流速度

2.2.1 抑制血小板活化

病理情況下，血小板在病變血管部位蓄積致血管閉塞，引起缺血性組織損傷和血栓栓塞癥，因此抑制血小板活化是抗血栓的重要一步。調(diào)節(jié)血小板功能概括起來包括花生四烯酸系統(tǒng)、環(huán)核苷酸系統(tǒng)和Ca₂+。

2.2.2 調(diào)節(jié)纖溶

纖溶是指纖維蛋白、纖維蛋白原被纖溶酶水解的過程，其主要作用是將沉積在血管外的纖維蛋白溶解，防止血栓形成。

（1）纖溶酶原激活劑。在體內(nèi)最基本的纖溶酶原激活劑是組織型纖溶酶原激活劑和尿激酶型纖溶酶原激活劑。其主要功能是將纖溶酶原激活成纖溶酶，啟動纖溶系統(tǒng)。

（2）纖溶抑制物。體內(nèi)纖溶抑制劑包括纖溶酶原激活抑制劑和纖溶酶抑制劑兩類，對纖溶系統(tǒng)起著重要調(diào)節(jié)作用。所以，提高纖溶酶原激活劑含量和減少纖溶抑制物含量，對抗血栓有重要意義。

2.3 避免內(nèi)皮細胞受損

在生理情況下，完整無損的血管內(nèi)皮細胞具有抗栓功能。因此避免內(nèi)皮細胞受損，是研究抗栓藥物的重要內(nèi)容。內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的與血栓有關的物質(zhì)主要有PGI2、EDRF與ET、vWF、TM、硫酸乙酰肝素與AT-Ⅲ、纖溶酶原激活劑與纖溶抑制物。

3 研究方法

3.1 實驗動物的選擇

各種血栓模型以大鼠最為常用，其次是兔和小鼠。對于器官血栓，也可選用大鼠、犬或者兔。

3.2 動物模型

3.2.1 光化學引起的大鼠局部腦血栓模型^[3]

手術方法：麻醉后，仰臥固定大鼠。將大鼠頭部右側(cè)臥位，從左眼和左耳之中點，做突向耳側(cè)長約2. 5cm 的弧形切口，分離顳肌，自顴弓前、后端剪斷并剪斷冠狀突。分離周圍軟組織暴露和顴弓相接的顳鱗骨。在顴弓與顳鱗骨交界的前下方用臺式牙科鉆車行顱骨鉆孔，用血管鉗擴大骨窗暴露左側(cè)MCA 近側(cè)段主干，保持硬膜完整。個別大鼠MCA 變異，如無明確主干或在嗅束水平就已分離則放棄不用。完全暴露大腦下靜脈和嗅束之間MCA 段后，先用濕生理鹽水棉球蓋住傷口待用，再做左側(cè)股靜脈插管備用。

血栓形成方法：選用激光如He2Ne和靜脈注射光敏劑如血卟啉衍生物。經(jīng)投射孔徑將3mm 的光導纖維引出并固定于架上，投照孔徑對準嗅束和大腦下靜脈間的MCA，纖維遠端距MCA約2mm，投照光能量密度大于640mW/ cm₂。激光照射MCA 同時，經(jīng)股靜脈插管緩慢注射12.5mg/kg體重血卟啉衍生物，注射時間超過1min，直接照射15min。在手術顯微鏡（Opton，West Germany） 下觀察到MCA 血流中斷并變?yōu)榘咨?，即為血栓形成?/p>

3.2.2 開顱電凝阻斷模型^[4]

手術方法：麻醉后，固定大鼠，沿眶上緣作弧形切口，分離眶內(nèi)結(jié)締組織后，可見視神經(jīng)孔，電凝切斷視神經(jīng)，在視神經(jīng)孔外上方開窗，切開硬腦膜，即可看到大腦中動脈，電凝并切斷大腦中動脈起始部至大腦下靜脈之間或者嗅束內(nèi)側(cè)2㎝至大腦下靜脈之間的一段大腦中動脈，敷少許青霉素鈉后逐層縫合顳肌和皮膚。術后用加熱墊維持動物體溫在37～ 38℃，蘇醒后送回原籠內(nèi)。

3.2.3 化學法血栓模型^[5]

手術方法：大鼠腹腔注射20%烏拉坦麻醉（5 mL?kg）。常規(guī)氣管插管，行人工呼吸，然后開胸斷第3、4肋骨，暴露心臟，打開心包膜，將吸有50%三氯化鐵溶液的濾紙片貼于大鼠的冠狀動脈前降支根部，2 min后大鼠腹腔注射氨甲苯酸（100 mg?kg），60 min后取下濾紙片。

3.2.4 光—色素法動脈血栓模型^[6]

手術方法：大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，氣管插管、頸動脈插管做血壓監(jiān)測。開腹，置腸系膜于生理鹽水恒溫槽中灌流，在顯微鏡下觀察腸系膜微循環(huán)狀況，經(jīng)顯微—攝像—錄像系統(tǒng)拍攝在正常狀況下微血管的流態(tài)。5m in 后打開熒光顯微鏡激發(fā)光光路，使特定波長的激發(fā)光照射在選定的目標血管段上，第6min 通過靜脈插管注入熒光素鈉FINa（2mL/kg），并以此時刻作為血栓模型建立的起始時間。在顯微鏡下或監(jiān)視器上觀察血栓生成的全過程并錄像，直至血栓完全栓塞目標血管。

3.2.5 靜脈血栓模型^[7]

手術方法：動物麻醉劑864麻醉后，于右側(cè)腹股溝區(qū)沿股動、靜脈走行切開皮膚8 cm，鈍性分離皮下及肌肉組織，充分暴露股靜脈，于遠端上動脈夾后切開股靜脈，向心方向安置自制螺旋銅絲進入股靜脈內(nèi)并縫合，去靜脈夾，手術視野檢查無滲血，術畢。

3.2.6 小鼠角叉菜血栓模型^[8]

造模：精密稱取角叉菜膠，以生理鹽水配成4%濃度，給大鼠稱重，于后足跖部皮下注射角叉菜膠，劑量為20 mg/ kg 體重。

3.3 檢測指標的選擇

（1）內(nèi)皮細胞功能測定：6-酮-PGE1a、NO與ET-1、VWF、TM測定。

（2）血小板功能測定：血小板黏附、聚集、釋放功能的測定、TXB2測定。

（3）凝血因子和抗凝物質(zhì)測定：凝血時間測定、凝血酶原時間、凝血酶時間測定、組織因子測定、AT-Ⅲ測定、蛋白C活性測定、組織因子抑制物活性測定。

（4）纖維蛋白溶解活性的檢測：D-二聚體測定、組織性纖溶酶原激活劑測定、纖溶酶原激活劑測定。

（5）血液流變性測定：黏度測定、紅細胞比容檢測、紅細胞沉降率測定、紅細胞電泳時間測定、紅細胞變形性測定。

（6）血栓相關指標測定：血栓重量、長度與血栓形成百分率、血栓形成時間、血流量、梗死面積或重量等。

參考文獻：

［1］ Hansson PO，WelinL，Tibbin G. Deep vein thrombosis and pul2monary embolism in the general population［J］ . Arch Intern Med，1997，29（3） ：263.

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［8］ 丁書文 .白酒對角叉菜膠所致大鼠尾部血栓形成的影響［J］.中國預防醫(yī)學雜志，2004，5（3）：161-163.

（責任編輯：姜付平）