產(chǎn)1,3-丙二醇克雷伯氏菌誘變菌株的發(fā)酵動力學研究

桂妍雯

蘭州交通大學化學與生物工程學院 （甘肅蘭州 730070）

技術進步

產(chǎn)1,3-丙二醇克雷伯氏菌誘變菌株的發(fā)酵動力學研究

桂妍雯

蘭州交通大學化學與生物工程學院 （甘肅蘭州 730070）

克雷伯氏菌是1,3-丙二醇（1,3-PD）生產(chǎn)菌。根據(jù)產(chǎn)酸克雷伯氏菌的誘變菌株Y-37的發(fā)酵過程曲線，對克雷伯氏菌生產(chǎn)1,3-PD的發(fā)酵動力學特性進行研究，提出了發(fā)酵過程中菌體生長、1,3-PD生物合成、甘油消耗的動力學模型，并應用matlab數(shù)值應用軟件對實驗數(shù)據(jù)進行擬合。該模型基本上能夠描述克雷伯氏菌的發(fā)酵過程，模型的計算值與實驗測定值能夠比較好地擬合。

克雷伯氏菌 1,3-丙二醇 動力學分析

1,3-丙二醇（1,3-PD）主要用于生產(chǎn)聚對苯二甲酸丙二醇酯（PTT）。PTT作為一種新型的纖維材料，具有優(yōu)異的回彈性、染色性、抗污性，較好的抗紫外線變色性能以及不易起靜電、吸水較少等特點，主要用于制造地毯、工程塑料、膜及紡織業(yè)的服裝材料等，因此1,3-PD的發(fā)展空間巨大，是目前研究的熱點。而隨著綠色工業(yè)的發(fā)展，用微生物法生產(chǎn)1,3-PD將成為研究的主要方向。迄今為止，國內(nèi)外對微生物生產(chǎn)1,3-PD的研究主要集中在培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝優(yōu)化方面，而對其發(fā)酵特性、發(fā)酵動力學研究的報道較少。本研究對克雷伯氏菌分批發(fā)酵生產(chǎn)1，3-PD的動力學進行了分析，建立了分批發(fā)酵過程的動力學模型。

1 材料與儀器

1.1 菌種

實驗室自選克雷伯氏菌的誘變菌株Y-37。

1.2 試劑

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鎂、硫酸銨、硫酸鈉、硫酸亞鐵、氯化鈣、氯化鉀、氯化鈉、氯化鎂、氯化鋰、氯化亞鐵、氯化鐵、葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸三鈉、乙醇、甘油、1,3-PD，分析純；牛肉膏、酵母浸粉、瓊脂，BR生物試劑。

1.3 儀器

分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）、電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］、托盤天平（北京大柵欄天平廠）、可調式電熱板（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、手提式壓力蒸汽滅菌鍋（山東新華安得醫(yī)療用品有限公司）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）、離心機（上海安亭科學儀器廠）、氣相色譜儀（日本島津分析儀器有限公司）、填充柱（北京迪馬科技有限公司）、冷凍恒溫振蕩器（太倉市實驗設備廠）、潔凈工作臺（上海博迅實業(yè)有限公司）、冰箱展示柜（澳柯瑪股份有限公司）、CO2厭氧培養(yǎng)箱、紫外誘變箱。

2 實驗內(nèi)容及方法

2.1 種子活化

將試管種子劃線接種至種子活化平板上，30℃培養(yǎng)18～20 h。

2.2 種子培養(yǎng)

在250 mL三角瓶中裝入50 mL種子培養(yǎng)液，接入單菌落，在搖床轉速180～200 r/min、37℃的條件下培養(yǎng)14～16 h。

2.3 分析測定方法

2.3.1 菌體量的測定

菌體質量濃度的測定采用分光光度法，以蒸餾水做空白，在650 nm波長下測發(fā)酵液的吸光度值（A650）。

2.3.2 發(fā)酵液殘余甘油及1,3-PD產(chǎn)量的測定

發(fā)酵液中的甘油、1,3-PD及其副產(chǎn)物的質量濃度都可以通過氣相色譜儀進行測定。檢測設備為1490高效氣相色譜儀，色譜柱為填充柱，長2 m，內(nèi)徑3 mm，柱溫210℃，汽化室溫度280℃，檢測器溫度260℃，載氣為N2，壓力100 kPa，空氣壓力40 kPa，氫氣壓力60 kPa，進樣量1 μL。

將發(fā)酵液以4 800 r/min的轉速離心20 min后取上清液，將上清液用孔徑為0.2 μL的膜進行過濾，最后將其在上述條件下進行氣相檢測。測得各物質的出峰面積，利用標準液所測得的峰面積及其質量濃度所對應的標準曲線進行計算。

3 結果與討論

3.1 發(fā)酵動力學曲線

對誘變菌株Y-37進行發(fā)酵試驗，繪制Y-37發(fā)酵過程的動力學曲線，見圖1。圖中描述了菌體量、1,3-PD和殘余甘油質量濃度隨發(fā)酵時間的變化情況?？梢钥闯?，誘變菌株Y-37的菌體生長曲線比較典型，其與殘余甘油曲線在細胞生長期間基本呈鏡像關系。在發(fā)酵的初始階段菌株的生長比較緩慢，1,3-PD的產(chǎn)量也較低。但是隨著菌體的生長進入對數(shù)期時，甘油被大量消耗，1,3-PD逐漸積累，發(fā)酵至第三天時，菌體生物量達到最大。在發(fā)酵后期，由于1,3-PD的逐漸積累對細胞的生長起到了抑制作用，發(fā)酵結束后菌體生物量A650為4.83，1,3-PD的質量濃度為31.76 g/L。

圖1 誘變菌株發(fā)酵罐分批發(fā)酵過程曲線

3.2 發(fā)酵動力學模型

發(fā)酵動力學是對發(fā)酵過程中各狀態(tài)參數(shù)隨時間變化規(guī)律的研究，發(fā)酵動力學模型的建立，對于發(fā)酵工藝條件的研究、反應過程的操作優(yōu)化以及系統(tǒng)、有效地控制發(fā)酵過程具有重要的理論研究意義，而且為小罐實驗數(shù)據(jù)的放大提供理論依據(jù)，體現(xiàn)其實際應用價值。建立發(fā)酵動力學的主要目的是更加深刻地了解微生物復雜的代謝過程和本質，通過建模的形式尋找最合適的操作條件，以期實現(xiàn)發(fā)酵過程的最優(yōu)化控制，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。發(fā)酵動力學模型一般由三部分組成，包括菌體生長動力學模型、產(chǎn)物形成動力學模型以及底物消耗動力學模型。

3.2.1 菌體生長動力學模型的建立

Monod方程是現(xiàn)代微生物生長動力學研究的理論基礎，是描述菌體生長最常用的模型。該模型是一種最簡單、典型的決定論均相非結構模型，通過下列假設建立：（1）如果菌體的生長為均衡型非結構式的生長，細胞的成分只需要用菌體質量濃度一個參數(shù)表示即可；（2）如果培養(yǎng)基中僅有一種物質為生長限制性底物，那么其他營養(yǎng)成分對微生物的生長不產(chǎn)生影響；（3）將微生物的生長看作簡單反應，并假設菌體得率為常數(shù)，沒有動態(tài)滯后。可見，Monod方程并不能完全反應微生物的生長規(guī)律，僅適用于細胞生長比較緩慢和細胞密度比較低的環(huán)境。一般情況下，Monod模型在描述菌體生長過程中不宜使用，而Verhulst-Pearl提出的Logistic equation（邏輯斯諦方程，又稱阻滯方程）對擬合菌體生長過程具有適用性，常用于描述單細胞生長動力學。Logistic模型的特點是菌體細胞開始增長緩慢，而在以后某一范圍內(nèi)迅速增長，達到某限度后，增長又緩慢下來，是典型的S型曲線,能真實反映間歇發(fā)酵過程中因菌體增長而抑制自身生長的現(xiàn)象。

Monod方程：

式中：μmax——菌體的最大比生長速率，h-1；Ks——Monod飽和常數(shù)，mmol/L；S——基質質量濃度，mmol/L；X——菌體質量濃度，g/L。

Logistic方程：

式中：Xmax——菌體最大質量濃度值，g/L。

由甘油發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD的發(fā)酵過程曲線可以看出，微生物的生長呈現(xiàn)明顯的S型，因此，本實驗采用Logistic方程來擬合菌體的生長。

3.2.2 1,3-PD形成動力學模型的建立

產(chǎn)物是指在細胞培養(yǎng)過程中代謝底物生成的除細胞生物量以外的物質。為了便于研究其形成過程，Garden根據(jù)產(chǎn)物的形成和菌體生長的內(nèi)在關系將產(chǎn)物的形成分成3類：（1）產(chǎn)物形成與菌體生長偶聯(lián)型：產(chǎn)物只產(chǎn)生于菌體生長階段；（2）產(chǎn)物形成與菌體生長部分偶聯(lián)型：部分產(chǎn)物形成于菌體生長階段，而當菌體處于生長穩(wěn)定期時形成部分或者大部分的產(chǎn)物；（3）產(chǎn)物形成與菌體生長非偶聯(lián)型：只要細胞存在，就會有產(chǎn)物生成。通用于這三種情況的模型一般用Luedeking-Piert方程來表示，該模型對于描述微生物代謝產(chǎn)物的生成普遍適用，它將產(chǎn)物生成率看作菌體生長量和菌體生長率的函數(shù)，用表達式可以表示為：

式中：α——與菌體生長率相關聯(lián)的產(chǎn)物合成常數(shù)；β——與菌體生長量相關的產(chǎn)物合成常數(shù)；x——菌體；p——產(chǎn)物；rx——菌體的比生成速率；rp——產(chǎn)物的比合成速率。

按不同的α和β常數(shù)值，可以將上述產(chǎn)物的合成動力學基本分成以下三種類型：當α＞0，β＝0時，為生長偶聯(lián)型；當α＞0，β＞0時，為部分生長偶聯(lián)型；當α＞0，β＜0時，為非生長偶聯(lián)型。

對于利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD的過程，實驗所用菌株Y-37在細胞生長的對數(shù)期和穩(wěn)定期，1,3-PD的合成都在進行，且產(chǎn)物的合成與基質的消耗成正比。因此，利用甘油生產(chǎn)1,3-PD的發(fā)酵過程屬于部分生長偶聯(lián)型，可用表達式（4）表示：

3.2.3 底物消耗動力學模型的建立

底物是指細胞生長必需的各種營養(yǎng)物質，根據(jù)基質的平衡原理，主要包括三個方面的消耗，首先用于細胞的生長，主要用于增加細胞；其次用于維持細胞的代謝，最終合成代謝產(chǎn)物；第三，用于維持細胞的基本生命活動。底物消耗的動力學模型可用公式（5）表示：

式中：Yx/s——碳源菌體生長得率常數(shù)，g/g；Yp/s——碳源產(chǎn)物生成的得率常數(shù)，g/g；mx——微生物細胞維持常數(shù)，g/(L·d)。

一般情況下，微生物細胞的碳源維持系數(shù)數(shù)值都很小，為使模型更簡化，可將菌體呼吸所消耗的基質歸結在菌體生長消耗之內(nèi)，將利用甘油進行分批發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD過程中的限制性基質消耗分為菌體細胞消耗和產(chǎn)物積累消耗兩部分，因此基質（甘油）消耗的模型方程可簡化成表達式（6）：

3.3 模型求解

根據(jù)公式（1）、（4）、（6），分別對圖1中的發(fā)酵菌株生長曲線、1,3-PD生成曲線和甘油消耗曲線進行擬合。根據(jù)實驗測得的數(shù)據(jù)，利用Matlab模型擬合工具包對確定的1,3-PD發(fā)酵動力學的模型參數(shù)運用非線性曲線進行擬合，將標準的麥夸特算法與通用全局優(yōu)化法相結合，且使參數(shù)與誤差的平方和最小，采用全局優(yōu)化的算法，通過收斂迭代的方法最后找出參數(shù)的最佳估計值，結果如表1所示。

表1 1,3-PD發(fā)酵生產(chǎn)動力學模型參數(shù)估計值

誘變菌株Y-37的β值趨于0，α值為77.8，由此表明克雷伯氏菌誘變菌株Y-37的1,3-PD發(fā)酵機制也是產(chǎn)物的形成與細胞的生長相偶聯(lián)。將上述模型參數(shù)估計值代入動力學方程，最終得到克雷伯氏菌發(fā)酵生產(chǎn)動力學模型為：

（1）菌體生長動力學模型

（2）1,3-PD生成動力學模型

（3）底物消耗動力學模型

3.4 模型擬合分析

由微生物代謝的本質和經(jīng)驗建立發(fā)酵動力學模型。一個好的數(shù)學模型需要經(jīng)過實踐的不斷驗證，在實踐中對擬合參數(shù)進行反復修正，才能更好地反映微生物細胞的發(fā)酵本質。本實驗采用標準麥夸特法與通用全局優(yōu)化法相結合方式，以收斂迭代法求取最優(yōu)估計參數(shù)，擬合參數(shù)結果見圖2～4。

由模型擬合值與實驗測定值的統(tǒng)計分析可知，實驗所構建的克雷伯氏菌發(fā)酵動力學模型，除個別點外，所建模型與克雷伯氏菌細胞生長及l(fā),3-PD生成過程中的實驗數(shù)據(jù)能較好地吻合，因此可以作為克雷伯氏菌發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD優(yōu)化控制的參考依據(jù)。

圖2 克雷伯氏菌細胞質量濃度測定值與模型值擬合曲線

圖3 甘油質量濃度測定值與模型值擬合曲線

4 結論

圖4 1,3-PD質量濃度測定值與模型值擬合曲線

（1）通過對克雷伯氏菌發(fā)酵過程曲線的分析可知，克雷伯氏菌Y-37菌體生長會達到最大飽和質量濃度；1,3-PD屬于次級代謝產(chǎn)物，1,3-PD的合成與細胞生長呈現(xiàn)部分相關。

（2）根據(jù)發(fā)酵過程所測實驗數(shù)據(jù)，選取合適的動力學模型，并通過分析軟件對模型參數(shù)進行非線性擬合。模型可表述為：（1）菌體生長動力學模型：dX/dt=0.78X(1-X/5.43)；（2）1,3-PD生成動力學模型：dP/dt=77.8dX/dt+0.007X；（3）底物消耗動力學模型：-dS/dt=13.158(dX/dt)+1.205(dP/dt)。

該模型基本上能夠描述克雷伯氏菌的發(fā)酵過程，模型的計算值與實驗測定值能夠比較好地擬合。因此，可以用于預測發(fā)酵過程中1,3-PD的產(chǎn)量，從而可以對發(fā)酵操作參數(shù)提出要求，初步實現(xiàn)發(fā)酵過程的優(yōu)化與控制。

Research on Fermentation Kinetics of Klebsiella Pneumoniae Mutant Strains for Producing 1,3-Propanediol

Gui Yanwen

Klebsiella pneumoniaeis the strain for producing 1,3-propanediol(1,3-PD).According to the fermentation curve of Y-37,the mutant strain of Klebsiella oxytoca,researched the fermentation kinetics characteristics ofKlebsiella pneumoniaeduring 1,3-PD production,put forward the kinetic model of cell growth,biosynthesis of 1,3-PD and consumption of glycerin in the fermentation process,and fitted the experimental data by numerical software matlab.The model could basically describe the fermentation process of Klebsiella pneumoniae,and the data calculated by the model fairly matched the experimental data.

Klebsiella pneumoniae;1,3-Propanediol;Kinetic analysis

（略）

TQ223.16+2

2014年6月

桂妍雯女1987年生碩士助教研究方向：微生物酶技術