抗菌抗病毒大黃素型蒽醌類成分提取分離技術(shù)的研究與應用

余玖霞　吳　超　丁　寧　李　銳　陳建偉

（1.南京中醫(yī)藥大學；2.南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210029）お

摘 要：經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)大黃素型蒽醌類化合物對細菌和病毒有明顯的抑制作用。該類化合物的分離和提純近年來取得了不少進展，發(fā)現(xiàn)了一些新技術(shù)、新工藝，使得提取、分離更加快速、有效。對國內(nèi)外抗病毒大黃素型蒽醌類成分提取分離技術(shù)及其應用作一概述，并展望其開發(fā)應用前景。

關鍵詞：大黃素型蒽醌衍生物；抗菌；抗病毒；提取分離技術(shù)

中圖分類號：R284.2文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）01-0042-04

大黃素型蒽醌類衍生物通常呈黃色，系由C₁₅至C₁₆組成的由8單位的醋酸-丙二酸形成的多酮棕櫚酸經(jīng)閉環(huán)、脫羧生成的一類化合物。常見的有大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素（結(jié)構(gòu)式如圖1所示）。其羥基分布于兩個苯環(huán)上，具有瀉下作用^[1]。近年來發(fā)現(xiàn)的大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素等4種游離大黃素型蒽醌類化合物對幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）均有較強的抑制生長作用，而大黃提取物（Rheum officilale extracts）有中等程度的抑制生長作用（見表1）^[2]。大黃蒽醌類化合物抗流感病毒的半數(shù)有效濃度（IC₅₀）為122.4μg/mL，治療指數(shù)（TI）為1.9，且對流感病毒抑制作用存在明顯的量效反應關系^[3]。Andersen DO等對多種蒽醌及其衍生物進行抗病毒篩選，結(jié)果顯示，具有羥基和甲基取代的大黃素型蒽醌衍生物對膜病毒如：皰疹性口炎病毒、單純皰疹病毒（HSV-1，2）、副流感病毒等均有抑制作用^[4]。另有研究表明，蘆薈大黃素對帶狀皰疹病毒、假狂犬病毒、流感病毒有滅活作用。電鏡復制檢驗發(fā)現(xiàn)，HSV膜受到部分破壞。因而提示了大黃蒽醌類對膜病毒有直接的殺滅作用。大黃素在光照影響下，對HSV-1顯示較強的滅活作用，它的衍生物對人巨噬細胞病毒也有抑制作用^[5]。該類成分通常以游離或苷的形式存在于蓼科大黃屬（rheum）、酸模屬（Rumex）和蓼屬（Polygonum），豆科決明屬（Cassia）等植物中。有關大黃素型蒽醌類衍生物的分離純化，除采用常規(guī)法外，近年來又出現(xiàn)了一些新技術(shù)，使得提取分離更加有效、快速?，F(xiàn)就一些常規(guī)提取技術(shù)與新技術(shù)在大黃蒽醌類成分分離上的應用作一綜述。

1 常規(guī)系統(tǒng)溶劑提取法

常規(guī)溶劑提取法是先用大量加熱乙醇反復多次提取，減壓濃縮后再用溶劑如苯、乙醚、戊醇、甲基丁酮或氯仿提取大黃中各種游離狀態(tài)的蒽醌衍生物，殘渣再以稀酸（硫酸或鹽酸）和溶劑（苯或氯仿）水解提取，不但費時，而且要消耗大量溶劑。改進的常規(guī)系統(tǒng)溶劑提取法見圖2^[6]。

2 新技術(shù)的應用

2.1 微波提取技術(shù)

微波萃取是利用微波來提高萃取率的一種最新發(fā)展起來的新技術(shù)。微波加熱屬內(nèi)部加熱過程，經(jīng)過微波輻射后能富集藥材中有效成分。具有選擇性高、操作時間短、溶劑耗量少、有效成分得率高的特點，被應用于中藥及天然化合物的生物活性成分提取等方面。

郝守祝等比較了微波提取法與常規(guī)提取方法的提取效率，考察了微波輸出功率、藥材粒徑、浸出時間對提取效率的影響，確定微波輸出功率為480W，60目大黃粉，微波提取20 min后，其所得游離蒽醌的含量明顯高于常規(guī)的水煎煮法，與95%乙醇回流提取法相當^[7]。沈嵐等在研究微波提取時，以大黃中總蒽醌的含量為評價指標，從提取率與提取速度兩方面進行了微波萃取與常用提取方法的比較研究，結(jié)果表明用微波萃取大黃 5 min的提取率已超過超聲提取法 60 min的提取率，15 min已達到或接近索氏提取法2h和水煎法的提取效果^[8]。胡秀麗等研究了大黃總蒽醌的微波輔助提取、超聲提取和索氏提取方法，并利用分光光度法測定了提取液中總蒽醌的含量。結(jié)果表明微波輔助提取法的提取率最高（達1.91%），是超聲法的1.13倍，是索氏提取法的1.29倍^[9-10]。2.2 超聲提取技術(shù)

超聲波是一種彈性機械振動波，能破壞植物藥材的細胞，使溶媒滲透到藥材細胞中，從而加速藥材中的有效成分溶解，以提高有效成分的提取率。

超聲技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于陸地及海洋植物的藥用成分的提取^[11]，如郭孝武用不同頻率的超聲波從大黃中提取大黃蒽醌類成分。與常規(guī)煎煮法提取相比，超聲技術(shù)無需加熱，且隨超聲波頻率不同而得率不同，尤以頻率為20 kHz的超聲提取后，大黃蒽醌成分的得率最高^[12]。張海暉等采用正交試驗設計法，以水為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)采用超聲波強化提取10min，對游離蒽醌的提取率即與水煎煮法煎煮60 min提取效果相當；并且以乙醇為提取溶劑的提取效果明顯好于水，幾種方法相比較，以乙醇作為提取溶劑的超聲波萃取法對大黃蒽醌的提取效果最好，明顯優(yōu)于常規(guī)煎煮法和乙醇回流法^[13-14]。王佩琪等采用超聲提取法以大黃游離蒽醌的提出率為目的，考察了提取時間、藥材粒徑、溶劑醇濃度3個因素，并經(jīng)正交試驗進行篩選，結(jié)果溶劑醇濃度對提取大黃游離蒽醌影響顯著，反應時間和顆粒徑數(shù)對提取大黃游離蒽醌的影響不顯著；經(jīng)與45%及95%乙醇加熱回流法進行比較，超聲法對大黃游離蒽醌的提取效率要明顯優(yōu)于乙醇加熱回流提取法，說明超聲提取法對中藥活性成分的提取效率較高^[15]。李霞等以游離蒽醌得率為指標，探討了超聲波強化大黃蒽醌的雙相水解工藝的主要因素；用正交實驗優(yōu)化了用超聲波強化大黃蒽醌的雙相水解工藝的工藝條件，實驗表明影響游離蒽醌得率的主次因素為：提取溫度>超聲功率>硫酸體積分數(shù)>提取時間^[16]。

2.3 超臨界CO₂流體萃取法

超臨界流體萃?。ê喎QSFE）是一種以超臨界流體代替常規(guī)有機溶劑，對中藥有效成分進行萃取和分離的新技術(shù)。具有萃取效率高和選擇性高、省時、萃取溶劑易揮發(fā)、萃取物干凈、對環(huán)境污染小、操作條件易改變的特點^[17]。萃取完成后，改變體系溫度和壓力，使超臨界流體變成普通氣體逸散出去。利用超臨界CO₂流體（SCF）作溶劑，可以從多種液態(tài)或固態(tài)混合物中萃取出待分離組分^[18]。Tateo 等采用纖維素酶處理掌葉大黃后，常壓下用乙醇進行提取，發(fā)現(xiàn)總蒽醌萃取率與酸水解相比有所提高。當操作條件位于臨界點之上時，在夾帶劑的存在下，CO₂就顯出超臨界狀態(tài)的特性，對大黃蒽醌類物質(zhì)具有較強的溶解能力，從而可以實現(xiàn)萃取分離^[19]。未作君等對大黃游離蒽醌的超臨界萃取工藝進行了優(yōu)化，當采用5mol?L^-1鹽酸、2g?L^-1淀粉酶和1g?L^-1纖維素酶對大黃結(jié)合蒽醌進行水解時，大黃結(jié)合蒽醌的糖苷鍵達到最優(yōu)水解，此時總蒽醌質(zhì)量分數(shù)分別為2.46%、2.33%和2.23%^[20]。陳衛(wèi)林等通過均勻設計試驗確定了超臨界二氧化碳流體萃取掌葉大黃中蒽醌類成分的最佳提取工藝條件是萃取壓力為 38 MPa，萃取溫度為70℃，萃取時間為 60 min，夾帶劑用量為 300mL^[21]。鄭志華等在研究大黃瀉下作用時，對大黃有效成分進行了普通水提、醇提等，幾種方式提取后，再將提取液過大孔樹脂柱進行精制，在以上4種方法中，二氧化碳超臨界萃取及提取液用樹脂精制工藝瀉下作用最強^[22]。劉玉敏等用正交設計法和方差分析考察影響超臨界流體萃取大黃蒽醌的5個因素及最佳萃取條件，以優(yōu)化SFE法提取工藝。當SFE最佳萃取溫度為70°C、壓力35 Mpa、甲醇劑量 0.6 L、靜態(tài)萃取時間 8 min及動態(tài)萃取體積 5 mL時，可用于大黃蒽醌的提取分離^[23]。Pyo D認為，對于極性較弱的油脂類物質(zhì)，采用少量的夾帶劑甚至不采用夾帶劑就能夠很好地被超臨界CO₂萃取出；但對于大黃游離蒽醌等強極性物質(zhì)，夾帶劑用量的多少則對改善大黃游離蒽醌在超臨界CO₂中的溶解性能具有決定性的影響^[24]。

2.4 大孔樹脂吸附分離法

大孔樹脂是20世紀60年代發(fā)展起來的一種新型吸附劑，既有物理吸附作用，又因多孔狀結(jié)構(gòu)而有篩選作用。該吸附劑在中藥有效成分分離提取的應用中，呈現(xiàn)出良好的發(fā)展勢頭^[25]。袁倚盛等用大孔樹脂吸附法，使總蒽醌的含量達到50%以上，收率較高^[26]。金波等以大黃總蒽醌的提取率及洗脫率為考察指標，考察大黃的提取條件及大孔吸附樹脂富集、純化大黃總蒽醌的吸附性能和洗脫參數(shù)。通過大孔吸附樹脂富集與純化，用70%乙醇洗脫，總蒽醌的洗脫收率在80%以上^[27]。許漢林等比較了D301、AB-8、X-5、NKA-2、H1020型號的5種大孔樹脂對大黃總蒽醌的吸附性能；以大黃總蒽醌中的代表成分大黃素為考察指標，結(jié)果D301樹脂對大黃總蒽醌的吸附性能最佳^[28-29]。黃園等在研究大黃總蒽醌純化工藝時，采用了4種方法（明膠沉淀法、醇調(diào)pH值法、聚酰胺法以及大孔吸附樹脂法）對大黃提取液富集效果進行研究，結(jié)果表明大孔樹脂對大黃總蒽醌的富集效果最好^[30]。王高森等以一個含有生物堿、蒽醌、皂苷等由黃連、大黃、知母等藥材組成的中藥復方為樣品，采用4種型號（LD605，F(xiàn)95-34，F(xiàn)95-36，F(xiàn)95-37）大孔樹脂進行吸附純化工藝和特性研究。結(jié)果表明，上柱藥液與上柱體積比以LD605型最高，可達10∶1，其余3種樹脂體積比僅為LD605型的80%～90%。對比4種樹脂的上柱量，分別以可溶性浸出物計、以大黃總蒽醌計，LD605型樹脂最高^[31]。劉峰群等以D101型大孔吸附樹脂分離大黃中結(jié)合型蒽醌提取物，加樣吸附1h，以足夠量水沖洗吸附柱，流速約1 mL?min^-1，至洗脫液幾乎無色。改用50%的乙醇液沖洗，采用比色法考察總提取物中結(jié)合型蒽醌類物質(zhì)的含量，總收率為87.6%^[32]。金汝城等對比5種大孔樹脂對大黃總蒽醌的吸附性能，以大黃總蒽醌為考察指標，對大孔樹脂吸附純化大黃總蒽醌的條件進行了篩選。結(jié)果S-8型樹脂對大黃總蒽醌適宜交換吸附條件為pH=9，流速為1 mL?min^-1，洗脫劑用5%氫氧化鈉和95%乙醇混合液，解吸效果較好。靜態(tài)交換容量為15.48 mg/g，動態(tài)交換容量為23.12 mL?g^-1，吸附率為92.01%，吸附性能較好^[33]。

2.5 離心薄層色譜分離法

離心薄層色譜法，又稱離心液相色譜法（Centrifugal Liquid Chromatograph，簡稱CLC），其分離原理是根據(jù)試樣在固定相和流動相之間的吸附、分配作用的不同，再加上離心加速度的作用，使試樣中各組分之間原有的R璮值差異加大，從而提高了分離效果。洪美芳等采用該法從決明子中分離結(jié)構(gòu)上極相似大黃酚和大黃素甲醚，只需1.5 h即能完成分離^[34]。

2.6 高速逆流色譜法

高速逆流色譜法（High-speedcounter-currentchromatography，簡稱HSCCC）是利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的不同，從而進行分離的色譜法。逆流色譜的發(fā)展從逆流分配、液滴逆流色譜到現(xiàn)在的HSCCC歷經(jīng)數(shù)十年，技術(shù)和設備日臻成熟，可廣泛應用于中藥及天然藥物的研發(fā)。有學者利用高速逆流色譜對傳統(tǒng)中藥大黃中的蒽醌類活性成分進行了制備分離研究，兩相溶劑分離系統(tǒng)采用了氯仿：甲醇：水（4：3.8：2）溶劑系統(tǒng)，并對制備品進行了薄層色譜分析，檢驗了其中的大黃素，證實了其中的蒽醌類成分，說明了該方法的有效性和實用性^[35]。黃健光等利用高速逆流色譜，采用加入酸堿的方法對大黃中的蒽醌類活性成分進行了分離研究，實現(xiàn)了分離純化過程一次完成；溶劑系統(tǒng)為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比為9∶1∶5∶5），三氟乙酸作為保留酸，氨水作為洗脫堿；用高效液相色譜分析分離產(chǎn)物，證明得到了大黃蒽醌的五種純物質(zhì)，較之傳統(tǒng)方法快速高效^[36]。Yang等利用乙醚-水的兩相溶劑系統(tǒng)，通過調(diào)整流動相pH值，采用梯度洗脫，從大黃中分離了大黃酚、大黃素、大黃素甲醚等羥基蒽醌類化合物，純度均大于98％^[37]。

2.7 毛細管電泳色譜技術(shù)

毛細管電泳（Capillary electrophoresis，簡稱CE）是近些年發(fā)展起來的一種常用于中藥活性組分微分離分析的新技術(shù)。具有柱效高、分離速度快、毛細管清洗方便快捷等特點。宗玉英等采用膠束電動毛細管電泳（MECC）以25 mmol/L十二烷基磺酸鈉（SDS）溶液中加入改性劑，在pH 10.96條件下分離測定了大黃素，蘆薈中大黃素、大黃酸的含量，回收率分別為99.9%～101.9%、98.2%～101.8%和99.2%～101.2%^[38]。

3 前景與展望

大黃素型蒽醌類衍生物對多種病毒和細菌具有抑制和殺滅作用，尤其是具有較強的抑制幽門螺桿菌活性作用，臨床顯示有較好的療效。新近應用的提取分離技術(shù)各有特點，可以快速分離、獲得有效成分單體或進行準確的定量，超臨界CO₂流體萃取法與酶制劑結(jié)合使用還可以實現(xiàn)蒽醌類提取物的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，新的提取分離技術(shù)為大黃素型蒽醌成分的開發(fā)利用和質(zhì)量控制開辟了廣闊的應用前景。

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（責任編輯：陳涌濤）