大豆磷脂中溶血磷脂酰膽堿含量測(cè)定方法研究

凌立新　楊仕軍　郎　濤

（1.重慶文理學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系，重慶 永川 402160；2.四川省江源天然產(chǎn)物有限公司，

四川 洪雅 620360；3.西藏藏藥集團(tuán)股份有限公司，四川 成都 610041）お

摘 要：目的：采用HPLC法測(cè)定大豆磷脂中有關(guān)物質(zhì)溶血性磷脂酰膽堿的含量。方法：采用C₁₈色譜柱，以甲醇-乙腈-水（50∶40∶10）為流動(dòng)相，紫外檢測(cè)器，進(jìn)樣量20μL。結(jié)果：大豆磷脂中主成分磷脂酰膽堿和溶血性磷脂酰膽堿能很好地分離檢出，LPC線性濃度范圍為2.3625μg/mL～189.0μg/mL；平均回收率98.05%，RDS為0.86%（n=6），溶血性磷脂酰膽堿的最低檢測(cè)限為1.0ng，所含其它物質(zhì)對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾。結(jié)論：該法準(zhǔn)確、靈敏、快捷，可作為大豆磷脂中有關(guān)物質(zhì)溶血性磷脂酰膽堿的測(cè)定方法。

關(guān)鍵詞：大豆磷脂；溶血性磷脂酰膽堿；HPLC

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2009）01-0035-02

大豆磷脂主要含有磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酸（PA）、溶血磷脂酰膽堿（LPC）、溶血磷脂酰絲氨酸（LPS）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、胞苷二磷酸（CDP）等。在大豆磷脂原料的制備、純化及其注射液的制備、貯藏過(guò)程中，均會(huì)有部分PC分解產(chǎn)生LPC，LPC具有溶血或溶解細(xì)胞膜作用，故對(duì)大豆磷酯中LPC含量需進(jìn)行嚴(yán)格控制。目前，對(duì)大豆磷脂中雜質(zhì)LPC含量測(cè)定的研究不太多，大多采用TLC和HPLC法。TLC法具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，但操作煩瑣。HPLC法雖具有快速、易于自動(dòng)化等特點(diǎn)，但所用檢測(cè)器多采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器，儀器價(jià)格昂貴。針對(duì)目前企業(yè)單位一般的液相配置的情況，為了快速、簡(jiǎn)便地測(cè)定大豆磷脂中的溶血磷脂酰膽堿，我們選擇紫外檢測(cè)器。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥

HP1100型高效液相色譜儀；PHS-2C型精密酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Sartorius211型電子天平；UV-2550型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）。

溶血磷脂酰膽堿（LPC）、磷脂酰膽堿（PC）對(duì)照品，Sigma公司；大豆磷脂（含磷脂酰膽堿量>90%），實(shí)驗(yàn)室自制；甲醇（色譜試劑）；乙腈（色譜試劑）。

1.2 色譜條件

HypersilC₁₈色譜柱：150mn×4.6mn，流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（50∶40∶10），柱溫：室溫，流速：1.0mL/min，進(jìn)樣量：20μL；紫外檢測(cè)器；進(jìn)樣量20μL。

1.3 對(duì)照品溶液和樣品溶液的配制

取樣品約25mg，精密稱(chēng)定，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得樣品試液。取溶血磷脂酰膽堿對(duì)照品約10mg，精密稱(chēng)定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即對(duì)照品溶液。吸取樣品試液和對(duì)照品溶液各20μL進(jìn)樣，即得。

2 結(jié)果

2.1 色譜的定性與分離

以甲醇-乙腈-水（50∶40∶10）為流動(dòng)相，對(duì)大豆磷脂中的磷脂酰膽堿（PC）和溶血磷脂酰膽堿能達(dá)到較好的分離。本法理論板數(shù)按磷脂酰膽堿計(jì)為8562；磷脂酰膽堿與溶血磷脂酰膽堿的分離度為5.76，PC的保留時(shí)間為17min，LPC保留時(shí)間約為22分鐘。分離的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 線性范圍

精密稱(chēng)取溶血磷脂酰膽堿對(duì)照品10.50 mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為預(yù)試液，分別吸取預(yù)試液適量，用甲醇稀釋制成濃度為2.3625μg/mL，9.45μg/mL，23.625μg/mL，47.25μg/mL，94.5μg/mL，189.0μg/mL的溶液，分別定量注入20μL，經(jīng)HPLC法測(cè)得峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=4256.9X+3193.5，r=0.9999。結(jié)果顯示，溶血磷脂酰膽堿在線性范圍2.3625μg/mL～189.0μg/mL內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3 精密度

精密稱(chēng)取溶血磷脂酰膽堿對(duì)照品9.12mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得對(duì)照品溶液，取此液連續(xù)進(jìn)樣5次，按峰面積計(jì)算精密度。測(cè)得平均峰面積為441169，RSD為0.1%。結(jié)果顯示，進(jìn)樣精密度良好。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取大豆磷脂樣品約12.5mg于50mL量瓶中；再精密稱(chēng)取溶血磷脂酰膽堿對(duì)照品約20.0mg于50mL容量瓶中，制得一定濃度的對(duì)照A液，再精密量取對(duì)照A液5mL，加入其中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，作為對(duì)照回收液，按1.3項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定。再按此方法制得5個(gè)對(duì)照回收液，測(cè)定。見(jiàn)表1。

2.5 穩(wěn)定性考察

取試驗(yàn)樣品，照1.3項(xiàng)下的方法，制得樣品液，在2~8℃放置，分別于0、2、4、6h進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積的變化考察供試液的穩(wěn)定性，RSD為0.97%，說(shuō)明本檢測(cè)方法的供試液在6h內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表2。

2.6 樣品測(cè)定

精密吸取3個(gè)批號(hào)的樣品溶液，另取LPC對(duì)照品溶液20μL，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分峰高為滿量程的10%～15%；再分別取對(duì)照品溶液和樣品溶液各20μL進(jìn)樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。結(jié)果，按外標(biāo)法計(jì)算出3個(gè)批號(hào)樣品中LPC占樣品總量的0.56%，0.64%，0.63%。

3 討論

（1）分別取PC和LPC對(duì)照品適量，在200nm~400nm范圍進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。確定有關(guān)物質(zhì)LPC檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm。此吸收波長(zhǎng)短，會(huì)造成檢測(cè)靈敏度不高，干擾嚴(yán)重，同時(shí)限制了流動(dòng)相的選擇。本實(shí)驗(yàn)中，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料，我們選擇了條件Ⅰ：正己烷-異丙醇-冰醋酸-三乙胺（梯度洗脫）；條件Ⅱ：異丙醇-水-冰醋酸-三乙胺（梯度洗脫）；條件Ⅲ：異丙醇-正己烷-水，為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明：大豆磷脂主峰能與其它雜質(zhì)峰有效分開(kāi)，但雜質(zhì)溶血磷脂酰膽堿與其它雜質(zhì)不能達(dá)到基線分離。調(diào)節(jié)酸堿性，對(duì)溶血磷脂酰膽堿與相鄰雜質(zhì)峰的分離度基本無(wú)影響。參照文獻(xiàn)［1］中流動(dòng)相的配比，采用甲醇-乙腈-水（50∶40∶10）為流動(dòng)相檢測(cè)，主峰保留時(shí)間約為17min，溶血磷脂酰膽堿與相鄰雜質(zhì)峰能達(dá)到基線分離。經(jīng)過(guò)本法研究，對(duì)大豆磷脂樣品（含PC量大于90%）中LPC含量測(cè)定，用本方法的條件測(cè)試，重現(xiàn)性較好，能滿足實(shí)測(cè)要求。

（2）逐級(jí)稀釋溶血磷脂酰膽堿對(duì)照液，測(cè)定溶血磷脂酰膽堿的峰高，同時(shí)測(cè)定相同條件下的色譜基線噪聲，取基線噪聲的10倍值作為溶血磷脂酰膽堿測(cè)定的定量限。本法測(cè)出溶血磷脂酰膽堿的定量限為1.0ng。

（3）在本文研究范圍內(nèi)，HPLC-UV法具有良好的線性關(guān)系、分析準(zhǔn)確度和分析精密度。該法可方便地檢測(cè)大豆磷脂中溶血磷脂酰膽堿的含量。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 盧學(xué)清，洪筱坤.HPLC法測(cè)定熊膽中磷脂類(lèi)化合物PC、PI和PE的含量［J］.中成藥，1999，21（7）：372-374.

［2］ 劉琳琳，張輝.大豆磷脂的開(kāi)發(fā)與利用［J］.陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，22（4）：50-53.［3］ 王威，張彤.高效液相色譜_蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法對(duì)大豆磷脂原料藥中各種成分的含量測(cè)定［J］.首都醫(yī)藥，2002（8）：49-50.

［4］ 蔣玲，陳亮.HPLC_ELSD法測(cè)定大豆磷脂注射液中有關(guān)物質(zhì)［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2007，31（8）：366-369.

（責(zé)任編輯：王尚勇）