神經(jīng)干細(xì)胞移植對損傷鼠腦ＳＴＡＴ３蛋白和ｂｃｌ－２蛋白表達(dá)水平的影響

周鳳剛　鄭永日　解洪軍　呂　鷗　趙　巖　李青松　王建交

[摘要]目的 通過試驗(yàn)檢測神經(jīng)干細(xì)胞移植后SD大鼠機(jī)械性腦損傷局部STAT3蛋白和bcl-2蛋白表達(dá)水平的變化,來研究移植入的神經(jīng)干細(xì)胞對損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡抑制作用和可能的機(jī)制。方法 SPF級SD大鼠40只,隨機(jī)分為4組,每組10只。取孕14天的SD胎鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)至第三代,于損傷后的24小時立體定向注射植入成年SD大鼠腦損傷局部。于移植24小時后取腦組織,免疫組化檢測bcl-2蛋白和Western blot法檢測STAT3蛋白表達(dá)的變化差異,進(jìn)而觀察神經(jīng)干細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的抑制作用。結(jié)果 移植入神經(jīng)干細(xì)胞后,局部STAT3蛋白和bcl-2蛋白的表達(dá)都比對照組明顯的增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 移植入的神經(jīng)干細(xì)胞通過上調(diào)STAT3蛋白和bcl-2蛋白的表達(dá),發(fā)揮抑制局部神經(jīng)元的凋亡作用,可將其作為腦損傷的治療方法進(jìn)一步加以研究。

[關(guān)鍵詞]神經(jīng)干細(xì)胞;腦損傷;bcl-2蛋白;STAT3蛋白;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號]R617 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號]1004-8650(2009)10-01-04

近年來神經(jīng)干細(xì)胞移植的研究取得了令人矚目的成績,被公認(rèn)為是治療不可逆性神經(jīng)損傷的最有效的方法。神經(jīng)干細(xì)胞移植在腦損傷的動物腦內(nèi)通過多種途徑的明顯改善神經(jīng)功能[2]。本實(shí)驗(yàn)通過早期分化的神經(jīng)干細(xì)胞移植于腦損傷的動物腦內(nèi),取得了同樣有效的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠(由哈爾濱獸業(yè)研究所提供)。1×PBS液(自配),0.25%的1∶250胰酶PBS溶液,D-hanks 液(自配),胎牛血清(Gibico),B27添加劑(Gibico)b-FGF,堿性成纖維細(xì)胞生長因子(PEPROTECH Asia),EGF,表皮細(xì)胞生長因子(PEPROTECH Asia)DMEM培養(yǎng)液(Gibico)20%血清的DMEM培養(yǎng)液,細(xì)胞凍存液(20%胎牛血清、12%無菌甘油、68%神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液),神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液(含有2% B27,EGF20ng/ml,b-FGF 20ng/ml的DMEM液)鼠立體定向儀(Narishige公司產(chǎn)品),相差倒置顯微鏡(OLYMPUS公司產(chǎn)品)。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)分化及BrdU標(biāo)記:取孕14天的SD大鼠,斷頭處死孕鼠,75%酒精浸泡10分鐘。無菌手術(shù)剖腹產(chǎn)取出胎鼠,放于盛有D-hanks液的95cm2培養(yǎng)皿中斷頭,取腦。無菌條件下剝除腦膜及血管,分離大腦皮質(zhì)配制成神經(jīng)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液用含bFGF(10ng/ml)和EGF(20ng/ml)并添加B27的DMEM/F12(1∶1)的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng),2-3天半量換液一次,7天傳代,將傳代培養(yǎng)第7天的細(xì)胞球吹散離心,換成含10%優(yōu)級胎牛血清的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基中分化培養(yǎng),取部分加入BrdU (20umol/L)培養(yǎng)3天,用胰酶消化貼壁細(xì)胞,并制成濃度為1×10,⁵細(xì)胞/100μl的細(xì)胞懸液備移植,行nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。

1.2.2 動物模型的制作[9] :300g清潔級SD大鼠,10%水合氯醛腹腔麻醉試驗(yàn)用鼠,俯臥位固定于手術(shù)臺上,顱頂部剪毛,消毒、鋪孔巾。顱頂正中線矢狀切開頭皮,以前囟后2.0mm、矢狀縫旁開2.0mm為中心,牙科鉆鉆開直徑為2.0mm的骨孔,保持硬膜完整。機(jī)械打擊致傷,傷后大鼠出現(xiàn)短暫的四肢抽搐、呼吸停止,瞳孔散大,持續(xù)時間約3-5秒鐘后醒轉(zhuǎn)。充分止血后骨蠟封閉骨孔,縫合頭皮。自然蘇醒,自由飲食。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞移植:將剩余的36只大鼠隨機(jī)分成4組,每組9只。在模型制備后第1天行靶點(diǎn)細(xì)胞移植,10%水合氯醛腹腔麻醉試驗(yàn)用鼠,將生理鹽水重懸的神經(jīng)干細(xì)胞懸液(2×10⁸個/ml)應(yīng)用微量注射泵以正三角形用微量注射器分三點(diǎn)注入硬膜下2.0mm深度。注射總量為6μl,注射時間為每點(diǎn)5min,留針5min后5min內(nèi)緩慢退針。完成后骨蠟封閉骨孔,縫合頭皮,自然蘇醒,自由飲食。對照組用生理鹽水代替細(xì)胞懸液,其他操作相同。

1.2.4 大鼠腦灌注固定及取材

1.2.4.1 免疫組化取材:10%水合氯醛將大鼠麻醉后開胸,經(jīng)左心室至主動脈插管,并以止血鉗固定,同時止血鉗夾閉降主動脈,剪開右心耳,先快速灌注預(yù)冷的4℃生理鹽水100ml左右,然后灌注4℃的4%多聚甲醛PBS緩沖液300-400ml。斷頭取腦,腦組織置于4%多聚甲醛PBS緩沖液固定24h,用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2.4.2 免疫組化檢測bcl-2蛋白表達(dá)含量,封片顯微鏡下觀察,照相,胞漿著色呈棕黃色為陽性細(xì)胞。

1.2.5 Western blot 取材

10%水合氯醛麻醉后迅速斷頭取腦。冰臺上分離損傷側(cè)腦組織。冰生理鹽水沖洗后,5ml凍存管封裝,放入液氮保存。

1.2.6 Western blot 檢測STAT3蛋白

①提取蛋白;②聚丙烯酰胺電泳;③配置凝膠;④蛋白電泳;⑤蛋白轉(zhuǎn)膜;⑥PVDF膜封閉;⑦抗體孵育;⑧蛋白顯色;⑨圖像采集:應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)采集并分析蛋白條帶。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

全部資料采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析,各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示在高倍物鏡下,取每張切片中損傷灶邊緣區(qū)域相互不重疊的4個視野,計數(shù)其中陽性細(xì)胞總數(shù),采用方差分析和組間t檢驗(yàn),比較各組間bcl-2蛋白陽性細(xì)胞數(shù)和STAT3蛋白強(qiáng)度面積。P<0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

各個時間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的照片

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞作為神經(jīng)發(fā)育的起始細(xì)胞,近年得到了廣泛的研究并成為熱點(diǎn)。其具有的自我更新能力和多分化潛能并通過分泌、激發(fā)損傷細(xì)胞的潛能而改變損傷區(qū)微環(huán)境[1]以此完成神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)作用已得到共識。隨著神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的成熟,使得人們更加想通過外源性的移植入神經(jīng)干細(xì)胞來治療神經(jīng)系統(tǒng)的損傷?，F(xiàn)在已經(jīng)有大量的動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其可行性和有效性,其確實(shí)能夠改善動物的行為功能活動。

腦損傷發(fā)生后,受損的局部腦組織在外力的機(jī)械作用下首先發(fā)生結(jié)構(gòu)的破壞和血管及細(xì)胞的碎裂、死亡,進(jìn)而細(xì)胞缺血缺氧,代謝紊亂,腫脹和增加死亡。其后又會因血液的重新灌注發(fā)生缺血再灌注損傷,而且在損傷區(qū)的半暗帶更為顯著,此時的細(xì)胞既可以是發(fā)生壞死也可以發(fā)生調(diào)亡。神經(jīng)干細(xì)胞的抗損傷作用主要有以下的兩個方面:一是外源性神經(jīng)干細(xì)胞的移植可以重建受損的神經(jīng)元回路。二是還可以通過移植細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子起到神經(jīng)保護(hù)作用。

本試驗(yàn)通過自孕14天的SD大鼠內(nèi)剖腹產(chǎn)取胎鼠腦進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng),經(jīng)nestin抗原免疫組化鑒定確為神經(jīng)干細(xì)胞后,[3]行鼠腦損傷區(qū)細(xì)胞移植。然后取腦進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)局部的Stat3蛋白和bcl-2蛋白的表達(dá)量明顯的高于非神經(jīng)干細(xì)胞移植組,而二者在細(xì)胞的凋亡發(fā)生過程中具有重要的作用。

Stat3是白細(xì)胞介素-6(IL-6)信號傳遞中的急性期反應(yīng)因子(acute-phaseresponsfactor,APRF)被純化的。編碼Stat3的基因在鼠科動物定位于第11號染色體,在人類定位于第12號染色體(q13至q14-1)。[7,8]Stat3mRNA(堿基對約5kb),廣泛表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織中,參與細(xì)胞生長、惡性轉(zhuǎn)化、凋亡等生理功能的調(diào)控。在不同的細(xì)胞系中,Stat3蛋白的活化具有介導(dǎo)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡雙重作用。[8]Stat3靶基因產(chǎn)物包括影響細(xì)胞凋亡的bcl-2家族成員bcl-2與bcl-xL,是bcl-2家族蛋白成員中主要的抑凋亡分子。bcl-xl基因啟動子上存在多個Stat3結(jié)合位點(diǎn),Stat3可直接與bcl-xl啟動子結(jié)合而啟動轉(zhuǎn)錄,琌rintani等[4]研究發(fā)現(xiàn)在某些情況下,則可能通過誘導(dǎo)bcl-2、bcl-xl等基因的表達(dá)而具有抗細(xì)胞凋亡的作用。bcl-2是在哺乳動物中最早發(fā)現(xiàn)的與凋亡有關(guān)的基因。bcl-2基因編碼一個25-26kD的膜蛋白,位于線粒體、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[2]。在各種正常細(xì)胞的激發(fā)和發(fā)育過程中表達(dá),而在成熟或走向凋亡的細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。其C末端的21個疏水氨基酸組成一個延伸的鏈狀結(jié)構(gòu)?？刹迦氲郊?xì)胞的膜結(jié)構(gòu)中,這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與其調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的方式和能力非常有關(guān)。首先,TBI后軸索崩解,軸索運(yùn)輸?shù)臓I養(yǎng)因子減少,神經(jīng)細(xì)胞因?yàn)槿狈I養(yǎng)因子而凋亡,而bcl-2蛋白的過表達(dá)可阻止神經(jīng)細(xì)胞因缺乏營養(yǎng)因子而致的凋亡。其次,研究證明,線粒體外膜通透性的改變可引起細(xì)胞凋亡,而這種通透性的改變直接由bcl-2蛋白家族控制[5]。細(xì)胞色素C(cyt-c)自線粒體外膜上形成的蛋白孔道釋放入胞漿是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。bcl-2家族對cyt-c的釋放具有最明顯的調(diào)控效應(yīng)。通過本試驗(yàn)我們觀察到隨著神經(jīng)干細(xì)胞的植入,損傷局部的Stat3蛋白和bcl-2蛋白的的表達(dá)量發(fā)生了增強(qiáng),這充分的表明移植的神經(jīng)干細(xì)胞參與了腦損傷的過程,也表明損傷的局部環(huán)境對植入的神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生了影響。在腦損傷后24h內(nèi)興奮性氨基酸、鈣離子、氧自由基以及細(xì)胞炎癥因子在細(xì)胞外間隙明顯增加,而移植后NSCs具有產(chǎn)生或分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用,可促進(jìn)自身的分化和TBI后的神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)。實(shí)際上增加了腦組織的抗損傷的能力,從分子水平增加了抗凋亡的成分,穩(wěn)定了線粒體,減少細(xì)胞的凋亡。這可能只是神經(jīng)干細(xì)胞移植對腦損傷治療作用的一個方面。但減少了原位神經(jīng)細(xì)胞的損失,也就是降低了損害的程度,這是有著非常重要的意義。但是人們同時也發(fā)現(xiàn)腦外傷12h以后,各種神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌也逐漸下降,而神經(jīng)營養(yǎng)因子對于神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化和遷移都起到重要的作用。另外,受傷時間越長,損傷灶內(nèi)膠質(zhì)瘢痕結(jié)構(gòu)就越緊密,這不利于神經(jīng)干細(xì)胞生長,同時也使其更難參與修復(fù)過程。綜合以上本實(shí)驗(yàn)選擇了24小時進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的移植,盡量的使其發(fā)揮更大的作用。同時希望本實(shí)驗(yàn)?zāi)軐δX外傷的臨床救治提供有益的線索,在腦外傷尤其是腦組織出現(xiàn)明顯的破壞的外傷以及腦外科術(shù)后的腦組織副損傷患者的治療開辟新的思路,即在其發(fā)生后的24小時進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的移植,減少腦細(xì)胞的死亡數(shù)量。改善患者的預(yù)后。神經(jīng)干細(xì)胞移植后提高了損傷局部的Stat3蛋白和bcl-2蛋白的表達(dá)量,但其確切的機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。是神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞因子的大量分泌激活了局部神經(jīng)元的基因表達(dá),各種抗凋亡的蛋白類分子數(shù)量增加?還是僅僅因?yàn)閷tat3蛋白起到了上調(diào)作用,再由后者進(jìn)一步的引起bcl-2基因的活化,bcl-2蛋白隨后增多?[6]細(xì)胞的凋亡是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)過程,bcl-2基因家族、caspase基因家族、NF-κB、P53基因等都參與了細(xì)胞的凋亡,是否神經(jīng)干細(xì)胞對其都有作用,還是有選擇的作用于腦損傷后凋亡調(diào)控的某一個或幾個方面?如何確定更有效的神經(jīng)干細(xì)胞移植量將是值得進(jìn)一步研究的問題。研究神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化、移植變化和影響的機(jī)制的最終目的是應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞治療疾病。人們正在進(jìn)行這各個方面的探索,神經(jīng)干細(xì)胞必將成為神經(jīng)科學(xué)工作的有用工具而不斷的發(fā)展,更好的為人類服務(wù)。

參考文獻(xiàn):

[1] Shigemi Matsuyama,Juan Llopis,Quinn L.et al.Reed Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol,2000,2(6):318-325.

[2] Othman Ghribi,David A,DeWitt,et al.Herman and John Savory.Co-involvement of mitochondria and endoplasmic reticulum in regulation of apoptosis:changes incytochromec,Bcl-2 and Bax in the hippocampus of aluminum-treated rabbits. Brain Res.2001,903(1-2):66-73.

[3] Michael A,Schumm,Daniel A,et al.Jacqueline Sagen Improved neural progenitor cell survival when cografted with chromaffin cells in the rat striatum.Exp Neural,2004,185(1):133-142.

[4] Lundberg C,Engkund U,Trono D.Differentiation of the RN33B cell line into forebrain projection neurons after transplantation into the neonatal rat brain. Exp Neurol,2002,175(2):370-387.

[5] OrreniusS.Mitochondrial regulationof apoptotic celldeath[J].Toxico lLett,2004,149(123):19223.

[6] Gil-Parrado S,Fernandez,Montalvan A.Assflg Machleidt I Ionomycin2 activated calpain trigges apoptosis:aprobable role for Bcl-2 family members [J].JBiolChem,2002,277(30):27217-27226.

[7] Schweizer U,GunnersenJ,WKarch.Conditional geneablation of stat3 reveals differential signalling requirements for survival of motoneurons during development and after nerve injury in the adult.CellBio.2002,156(2):287-297.

[8] Arrieta2Cruz I,PfaffDW, Shelley DN.Mouse model of diffuse brain damage following anoxia,evaluated by a new assay of generalized arousal[J].Exp Neurol, 2007,205(2):449-460.

[9] George Paxinos,Charles Watson著,諸葛啟釧譯.《大鼠腦立體定位圖譜》.人民衛(wèi)生出版社,2005:6.

(收稿日期2009-07-09)