ERK通路影響惡性黑色素瘤細(xì)胞周期的機(jī)制

李厚勇 周 梁 田 潔

[摘要] 目的 研究ERK信號(hào)通路對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制。方法 選用持續(xù)活化的ERK細(xì)胞株A-375,用MEK抑制劑PD98059阻斷ERK信號(hào)通路,觀察細(xì)胞生長曲線并用MTT法觀察細(xì)胞增殖,用Western蛋白印跡法檢測活化的ERK和細(xì)胞周期蛋白Cycline D1的表達(dá),用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。結(jié)果ERK信號(hào)通路阻斷后,細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1無表達(dá),G0-1期細(xì)胞所占比例明顯增加(P<0.01),S期細(xì)胞所占比例明顯降低(P<0.01)。結(jié)論 ERK信號(hào)通路阻斷后,細(xì)胞阻滯于G0-1期。其機(jī)制與細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的合成抑制有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 惡性黑色素瘤;ERK;細(xì)胞周期;細(xì)胞周期素D1

[中圖分類號(hào)] R364.7[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1004-8650(2009)12-033-04

目前研究發(fā)現(xiàn)皮膚惡性黑色瘤中存在細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extra cellular regulated protein kinase ERK)的持續(xù)活化,其所占比率為78.5%(8),而ERK信號(hào)通路是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者,參與了正常細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、分化、死亡過程,其在不同細(xì)胞中的作用有所不同。在正常細(xì)胞中,其活化與細(xì)胞外信號(hào)刺激有關(guān)。那么ERK的持續(xù)活化在惡性黑色素瘤細(xì)胞起何作用,其作用機(jī)制又如何呢?本實(shí)驗(yàn)用ERK信號(hào)通路阻斷劑PD98059阻斷惡性黑色素瘤細(xì)胞株A-375中ERK的活化,觀察黑色素瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的變化,擬對(duì)上述問題進(jìn)行初步研究。

1材料與方法

1.1惡性黑色素瘤細(xì)胞株A-375來源于中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞所。

1.2試劑與儀器

1.2.1主要試劑:PD98059(Cayman 公司),以DMSO溶解,PBS稀釋,兔抗人Cycline D1抗體(Cell Signaling technology 公司),DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serumFBS)、胰蛋白酶(均為GIBCO公司)。Propidium iodide (PI),噻唑藍(lán)(MTT)。

1.2.2主要儀器:COULTER Epics XL 流式細(xì)胞儀(COULTER公司),相差顯微鏡(Leica 公司),BIO-RAD model 680 microplate READER 酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司)。

1.2方法

細(xì)胞生長曲線:用惡性黑色素瘤細(xì)胞株A-375以6X104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于24孔板,培養(yǎng)液為含10%FBS、青鏈霉素雙抗的DMEM,24小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液換成10%FBS、50μMPD98059、青鏈霉素雙抗的DMEM,對(duì)照組培養(yǎng)液不變。然后每隔24小時(shí)任意選取3孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),連續(xù)6天,繪制出細(xì)胞生長曲線。

MTT檢測:將A-375細(xì)胞以5X103個(gè)/孔的密度接種于96孔板,培養(yǎng)液為含10%FBS、青鏈霉素雙抗的DMEM,24小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液改為培養(yǎng)液為含10%FBS、50μMPD98059、青鏈霉素雙抗的DMEM,另設(shè)一組為空白對(duì)照組(只加培養(yǎng)液、MDMSO,不加細(xì)胞),每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。按照MTT常規(guī)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別于培養(yǎng)后24h、48h、72h后檢測各孔490nm吸光度A值。

Western蛋白印跡法檢測各組細(xì)胞中磷酸化ERK酶和CyclineD1的表達(dá):抽提培養(yǎng)24h各組細(xì)胞總蛋白后,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,然后用轉(zhuǎn)移槽將蛋白質(zhì)從凝膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用抗體耦聯(lián)物進(jìn)行免疫檢測,用發(fā)光底物顯跡。

細(xì)胞周期檢測:用惡性黑色素瘤細(xì)胞株A-375以1X106個(gè)細(xì)胞/瓶的密度接種在含10%FBS、青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)瓶中,24小時(shí)后分別換成10%FBS、青鏈霉素雙抗的DMEM,10%FBS、青鏈霉素雙抗、50μMPD98059的DMEM。培養(yǎng)72小時(shí)后檢測細(xì)胞周期。

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期:吸出到期培養(yǎng)細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)液,加入0.25%的胰酶1ml,在室溫下消化細(xì)胞1分鐘,吸出胰酶,加入培液吹打制成細(xì)胞懸液,移入離心管,以1500rpm離心5分鐘,棄上清液,加入4。C0.01MPBS,輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮,以1500rpm離心5分鐘,棄上清液,重復(fù)2次,將細(xì)胞重懸于400μl DNA-PREP LPR 液中,避光室溫下反應(yīng)15分鐘,再加入100μl PI搖勻,避光室溫下反應(yīng)15分鐘,上機(jī)檢測。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示,兩組比較采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

MTT法顯示PD98059組吸光A值明顯低于10%FBS組,兩組間P值分別為24h P=0.012<0.05, 48h P=0.001<0.01, 72h P=0.001<0.01見表1

Western檢測結(jié)果

PD98059作用24h 細(xì)胞中無磷酸化ERK酶及細(xì)胞周期蛋白CyclineD1的表達(dá)

用t檢驗(yàn)比較兩組各期細(xì)胞差異,發(fā)現(xiàn)PD98059組G0-1期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(p=0.001<0.01),而S期細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組(p=0.001<0.01),G2期差異無顯著性(p=0.248>0.05)(表2)。

相差顯微鏡觀察兩組細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)PD98059作用72小時(shí)組的細(xì)胞較對(duì)照組稀疏,且出現(xiàn)凋亡(圖六、圖七)。

3討論

細(xì)胞周期也稱細(xì)胞分裂周期(Cell-Division Cycle),是指一個(gè)連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次分裂完成開始,到下一次分裂完成為止所經(jīng)歷的全過程?？蓪⑵浞譃?個(gè)時(shí)期(1):G1期、S期、G2期和M期。正常細(xì)胞的生長增殖受細(xì)胞外信號(hào)的調(diào)節(jié),許多影響細(xì)胞增殖的調(diào)控都發(fā)生在細(xì)胞周期的G1期,細(xì)胞在不適合的條件下會(huì)減慢或停止分裂,細(xì)胞周期的行進(jìn)停滯在G1期,細(xì)胞進(jìn)入一種靜息狀態(tài),稱為G0期。細(xì)胞在G0期可以長期存活而不增殖,當(dāng)受到增殖信號(hào)的刺激后,G0期的細(xì)胞可以重新回到G1期。

細(xì)胞周期行進(jìn)是由細(xì)胞周期蛋白依賴的蛋白激酶CDKs(Cyclin-dependent kinase)觸發(fā)的,CDKs通過對(duì)靶蛋白(通常是和復(fù)制、轉(zhuǎn)錄有關(guān)的因子)的磷酸化改變其活性,從而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的運(yùn)行(2)。具有細(xì)胞周期調(diào)控功能的CDKs大都是Cyclin依賴性的。Cyclin是CDKs的活化亞單位Cyclin即周期蛋白或周期素,因其表達(dá)水平在細(xì)胞周期過程中的時(shí)相性波動(dòng)而得名。在細(xì)胞周期調(diào)控中較為關(guān)鍵的細(xì)胞周期蛋白Cyclin有A、B、D、E等。根據(jù)其含量累積達(dá)到高峰時(shí)所處的細(xì)胞周期時(shí)相不同,可以將Cyclin分為兩類:G1期和M期Cyclins。前者包括Cyclin D、E,后者主要有CyclinA、B。

Cyclin D主要作用于G0/G1期轉(zhuǎn)換,它是外部生長信號(hào)的主要感受器,它的轉(zhuǎn)錄、合成都依賴于生長信號(hào)調(diào)節(jié)。生長信號(hào)通過Ras-Raf-1-MEK-MAPKs等級(jí)聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的介導(dǎo),傳入核內(nèi),激活Cyclin D1基因的啟動(dòng)子,從而使Cyclin D1表達(dá)水平上升,與CDK4/6結(jié)合并激活后者的活性(3,4,5),使細(xì)胞進(jìn)入分裂周期開始分裂增殖。

目前研究發(fā)現(xiàn)ERK酶的活性在惡性黑色素瘤中持續(xù)增高(8,9),其腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),且Sauter等(7)等研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 在惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖中起著重要作用。那么持續(xù)活化的ERK酶是否導(dǎo)致惡性黑色素瘤細(xì)胞Cyclin D1基因的持續(xù)表達(dá),從而使Cyclin D1表達(dá)水平上升,促使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂周期,引起腫瘤細(xì)胞的異常增殖?

為研究這一問題,我們用PD98059阻斷ERK信號(hào)通路并用Western蛋白印跡法檢測Cyclin D1的表達(dá),并觀察惡性黑色素瘤細(xì)胞周期的變化。PD98059是MEK的阻斷劑(6),可以抑制MEK的磷酸化,從而抑制ERK的磷酸化,阻斷ERK信號(hào)通路,是研究ERK信號(hào)通路在細(xì)胞中作用時(shí)常用的藥物。在我們的實(shí)驗(yàn)中可以看到,在惡性黑色素瘤細(xì)胞株A-375中,存在持續(xù)活化的ERK,且Cyclin D1 呈陽性表達(dá),當(dāng)用了該阻滯劑后,沒有活化的ERK表達(dá),ERK信號(hào)通路被阻斷。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出ERK信號(hào)通路被阻斷后,細(xì)胞周期蛋白D1呈陰性表達(dá),腫瘤細(xì)胞增長停滯。通過對(duì)細(xì)胞周期的分析,發(fā)現(xiàn)ERK信號(hào)通路阻斷后,G0-1期細(xì)胞比例明顯上升,差異有顯著性,而S期細(xì)胞明顯減少,差異也有顯著性,這說明ERK信號(hào)通路阻斷后,對(duì)細(xì)胞周期的影響在于阻止G0-1期進(jìn)入S期,而不影響已進(jìn)入S期的細(xì)胞進(jìn)入G2期,這樣就造成了G0-1期細(xì)胞比例上升,而S期細(xì)胞比例下降。

從我們的試驗(yàn)結(jié)果可以看出惡性黑色素瘤中ERK酶的活性持續(xù)增高,可以導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá),引起細(xì)胞進(jìn)入分裂周期,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。 附圖

參考文獻(xiàn)

[1] Sherr CJ. Mammalian G1 cyclins.Cell. Vol 73 (6),1993: 1059-1065.

[2] Chellappan SP,Giordano A, Fisher PB.Role of cyclin-dependent kinase and their inhibitors in cellular differentiation and development. Curr Top Microbio. Vol 227 1998:57-103

3 Chang F,Steelman LS, Lee JG, et al. Regulation of cell cycle progression and apoptosis by the Ras/Raf/MEK/ERK pathway. Int J Oncol vol 22(3),2003:469-480.

4 Strniskova M,Barancik M,Ravingerova T. Mitogen-activated protein kinases and their role in regulation of cellular processes. Gen Physiol Biophys,vol 21(3),2002:231-255

5 Zhang W,Liu HT,. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferationin mammalian cells. Cell Res,12(1),2002:9-18.

6 Dudley DT,Pang L,Decker ST,et al.A synthetic inhibitor of the mitogen-activated protein kinase cascade. Pro.Natl.Acad.Sci. vol 92 1995:7686-7689

7 Sauter ER,Yeo UC, von Stemm A,et al. Cyclin D1 is a candidate oncogene in cutaneous melanoma.Cancer Res,vol 62,2002:3200-3206.

8 Takata M,Goto Y,Ichii N,et al. Constitutive activation of the mitogen-activated protein kinase signaling pathway in acral melanomas.J Invest Dermatol,vol 125,2005:318-322

9 Cohen C, Zavala PA,Sequeira JH,et al.Mitogen-actived protein kinase activation is an early event in melanoma progression. Clin Cancer Res.vol 8,2002:3728-3733

(收稿日期2009-10-26)