分子標記技術(shù)在甜瓜育種中的應(yīng)用研究進展

劉　英　陳柏杰　金榮榮　汪　磊　曹　虹　尹春花　于守江

摘要：綜述了DNA分子標記的優(yōu)勢、種類及DNA分子標記技術(shù)在甜瓜育種中的應(yīng)用研究進展，對DNA分子標記在當(dāng)前甜瓜育種應(yīng)用中存在的問題進行了分析，并對甜瓜分子標記的應(yīng)用前景進行了展望。

關(guān)鍵詞：DNA；分子標記；甜瓜；育種

近年來，生物技術(shù)的發(fā)展為植物遺傳育種提供了基于DNA多態(tài)性的分子標記，分子標記技術(shù)作為常規(guī)育種有力的輔助工具，其重要性早已為國際瓜菜育種界所公認。廣義的分子標記(molecular marker)是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。狹義的分子標記概念只是指DNA標記，而這個界定現(xiàn)在被廣泛采納。分子標記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。

1分子標記的種類

分子標記是遺傳標記的一種，與形態(tài)標記、細胞標記、生化標記3種標記相比，分子標記具有顯著的優(yōu)越性：(1)大多數(shù)分子標記是共顯性的，對隱性農(nóng)藝性狀的選擇十分便利；(2)基因組變異極其豐富，分子標記的數(shù)量幾乎是無限的；(3)在發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析。使得對植株基因型的早期選擇成為可能。

依據(jù)對DNA多態(tài)性的檢測手段，目前DNA分子標記可分為4大類：第1類：為基于DNA-DNA雜交的DNA標記。該標記技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶酶解及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子，然后用經(jīng)標記的特異DNA探針與之進行雜交，通過發(fā)射自顯影或非同位素顯色技術(shù)來揭示DNA的多態(tài)性。其中最具代表性的是發(fā)現(xiàn)最早和應(yīng)用廣泛的RFLP標記。第2類：為基于PCR的DNA標記。根據(jù)所用引物的特點。這類DNA標記可分為隨機引物PCR標記和特異引物PCR標記。隨機引物PCR標記包括RAPD標記、ISSR標記等，其中RAPD標記使用較為廣泛。特異引物PCR標記包括SSR標記、STS標記等。其中SSR標記已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位等領(lǐng)域。第3類：為基于PCR與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的DNA標記。這類DNA標記可分為2種類型。1種是通過對限制性酶切片段的選擇性擴增來顯示限制性片段長度的多態(tài)性，如AFLP標記。另1種是通過對PCR擴增片段的限制性酶切來解釋被擴增區(qū)域的多態(tài)性，如CAPS標記。第4類：為基于單核苷酸多態(tài)性的DNA標記，如SNP標記。該標記是由DNA序列中因單個堿基的變異而引起的遺傳多態(tài)性。目前SNP標記一般通過DNA芯片技術(shù)進行分析。以上四大類DNA標記，都是基于基因組DNA水平上的多態(tài)性和相應(yīng)的檢測技術(shù)發(fā)展而來的，這些標記技術(shù)各具特點并在甜瓜育種中有著各自的優(yōu)勢。

2分子標記技術(shù)在甜瓜育種中的主要應(yīng)用進展

甜瓜是一種世界性的園藝作物，果實香甜可口，是我國廣大城鄉(xiāng)人民普遍喜食的傳統(tǒng)鮮食水果。我國甜瓜栽培已有3 000多年的歷史。是世界上最早栽培甜瓜的國家之一，也是世界上甜瓜栽培面積最大、產(chǎn)量最高的國家之一。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，國內(nèi)對甜瓜的需求量日益增長。

分子標記作為一種基本的遺傳分析手段已開始滲透到蔬菜遺傳育種研究的各個方面。甜瓜作為蔬菜作物的一種也不例外。分子標記技術(shù)的出現(xiàn)，使甜瓜育種中的“間接選擇”成為可能，大大提高了遺傳分析的準確性和選擇育種的有效性。因而分子標記在甜瓜育種中愈來愈受到重視。甜瓜分子標記與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，即分子標記輔助育種(mark-er-assisted selection，MAS)將成為今后甜瓜遺傳育種者的主要技術(shù)手段。當(dāng)前的分子標記技術(shù)主要廣泛應(yīng)用在甜瓜研究以下領(lǐng)域：

2.1瓜類親緣關(guān)系分析及種質(zhì)資源鑒定

分子標記所檢測的是植物基因組DNA水平的差異，其可用引物多，借助分子遺傳圖譜對品種之間的比較可覆蓋整個基因組，分子標記技術(shù)可為甜瓜物種、變種、品種和親緣類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供大量的DNA分子水平的證據(jù)。分子標記為品種資源的鑒定與保存、探究作物的起源與發(fā)展進化等提供了可靠的理論依據(jù)。

劉萬勃等利用RAPD和ISSR分子標記技術(shù)對37份甜瓜種質(zhì)進行了遺傳多樣性研究，將供試材料分為兩大類群：野生甜瓜和栽培甜瓜，其中栽培甜瓜又分為厚皮甜瓜和薄皮甜瓜兩大亞群。Baudra-co-Arnas等目利用RFLP技術(shù)用32個探針準確鑒別了甜瓜栽培種與野生種。Staub等運用多種分子標記手段對多個國家的甜瓜等瓜類種質(zhì)資源的種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性分析等進行了大量的研究，對甜瓜等作物的遺傳圖譜構(gòu)建過程中作圖親本的選擇以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常規(guī)育種和分子標記輔助選擇做出了巨大貢獻。張東曉用14種12個堿基的隨機引物對厚皮甜瓜4個品種及13個品系進行隨機擴增多態(tài)性RAPD分析。結(jié)果表明，可用其中6種引物將4個品種及13個品系加以鑒別。不同引物所擴增的特有或缺少的特異性條帶可作為鑒定這些品種或品系的分子標記。在RAPD分析基礎(chǔ)上計算的4個品種及13個品系之間的遺傳相似性系數(shù)，與其已知來源及彼此間已知的親緣關(guān)系均很符合。陳勁楓等采用SSR和RAPD 2種分子標記對黃瓜屬22份不同類型材料的親緣關(guān)系進行了研究。結(jié)果表明，野黃瓜(Cucumis hystrix)與黃瓜(Cucumis sativus L.var.sativus，2n=14)間的遺傳距離(SSR:0.59；RAPD:0.57)小于其與甜瓜(Cucumis melo L.var.melo，2n=24)間的距離(SSR:0.87；RAPD:0.70)。Katzir等通過7對SSR特異引物對8份甜瓜種質(zhì)、11個黃瓜種質(zhì)、5個南瓜種質(zhì)、3個西瓜種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明甜瓜比黃瓜、南瓜、西瓜等的遺傳多樣性要高。

2.2甜瓜遺傳圖譜構(gòu)建

遺傳圖譜的構(gòu)建是基因組研究中的重要環(huán)節(jié)，是目的基因分離及序列分析、基因結(jié)構(gòu)和功能鑒定、目標性狀分子標記的建立及比較基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)。構(gòu)建甜瓜遺傳圖譜，為甜瓜種質(zhì)資源進行抗病基因和重要農(nóng)藝性狀基因的定位，鑒定與之緊密連鎖的分子標記帶來了極大的方便。由于形態(tài)標記和生化標記數(shù)目少，特殊遺傳材料培養(yǎng)困難及細胞學(xué)研究工作量大等原因，應(yīng)用這些標記所得到的園藝植物較為完整的遺傳圖譜很少，而分子標記可以提供大量的遺傳標記，而且可顯著提高構(gòu)建遺傳圖譜的效率。從而為甜瓜品種資源的研究、基因定位、育種中親本材料的選擇選配、育種方案的制定奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)前利用分子標記構(gòu)建甜瓜遺傳圖譜已取得了如下進展。

Wang等構(gòu)建第1張?zhí)鸸匣亟缓蟠姆肿庸羌軋D譜，含有197個AFLP位點、6個RAPD位點與1個微衛(wèi)星位點，覆蓋1 942cM遺傳距離。Baudracco等在218株F2代群體上用34個RFLP標記、64個

RAPD標記、1個同功酶標記、4個抗病基因位點標記和1個形態(tài)學(xué)標記構(gòu)建了甜瓜的第1張分子遺傳圖譜，包含了14個連鎖群，共1390cM的基因長度，標記間的平均距離為12.6cM。

2001年Oliver等構(gòu)建了甜瓜的連鎖圖譜，其具有9個連鎖群，遺傳距離跨度為1 197cM，411個標記(234個RFLP，94個AFLP，47個RAPD，29個SSR，5個內(nèi)部SSR，2個同功酶)和1個形態(tài)學(xué)性狀。其中66％的標記是共顯性標記，這些標記可以作為融合甜瓜和黃瓜圖譜的參考。王建設(shè)等選用2個中國甜瓜地方品種的自交系4G21×3A832為作圖親本。利用SRAP標記構(gòu)建了遺傳圖譜。該圖譜覆蓋基因組總長2 077.1cM，共12個連鎖群，平均密度為11.1cM／位點。鄒明學(xué)、許勇等指出植物遺傳連鎖圖譜的發(fā)展趨勢是高飽和化、實用化和通用化。但是，目前的分子標記技術(shù)構(gòu)建的甜瓜遺傳圖譜密度還不夠高。實驗表明。RAPD、AFLP、SSR標記數(shù)量有限，難以使遺傳圖譜達到飽和，在甜瓜分子遺傳圖譜構(gòu)建中標記偏分離比率變異為5.8％～19.8％。

2002年，Perin等完成了甜瓜的2張永久性群體遺傳圖譜的構(gòu)建，并通過116個共同標記進行了圖譜整合，利用Védrantais×PI 161375和Védrantais×PI 414723分別構(gòu)成2個重組自交系為作圖群體，整合后的圖譜覆蓋基因組長度為1 654cM，分成12個連鎖群，包含有668個AFLP標記，25個RFLP標記，128個ISSR標記。16個RAPD標記，9個已知功能基因探針和23個形態(tài)學(xué)標記。整合后的圖譜包括大量的IMA標記，因此這張以永久性群體為作圖群體的甜瓜圖譜可與以前發(fā)表的甜瓜圖譜進行整合，然后來增加圖譜的飽和度和通用度。

2007年，Zalaoa等用USDA846-1和TooMark雜交獲得的有81個植株組成的重組自交系群體構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜是最新的1張?zhí)鸸线z傳連鎖圖譜。該圖譜由190個標記組成，包括114個RAPD、43個SSR、32個AFLP和1個表型位點，分成15個連鎖群，覆蓋基因組長度為1116cM，標記平均距離為5.9cM，并對37個OTL進行了定位和分析。Ed-uardo等㈣還利用PI 161375(Songwhancharml SC)×PieldeSapo(PS)構(gòu)建了由57個單株組成的近等基因系(nearisogenic lines NILs)的DHLs作圖群體，并進行了遺傳圖譜的研究和基因滲入方面的研究。Morales等進行了SNP分子標記在甜瓜圖譜構(gòu)建方面的研究，在15kb的甜瓜DNA序列中成功找到并定位到3個SNP分子標記，該項研究表明SNP在甜瓜中有很高的多態(tài)性，為SNP標記在甜瓜及葫蘆科遺傳圖譜的構(gòu)建進行了重要嘗試。隨后他們還進行了物理圖譜以及基因圖位克隆(map-based-cloning)方面的研究。

2.3甜瓜農(nóng)藝性狀定位

Park等。使用ms-3xMission和ms-3xTAM Dulee2個F₂代群體。獲得了與甜瓜雄性不育的ms-3基因連鎖的RAPD標記OAM08.650。在ms-3xTAMDulce群體中，該標記與榭-3基因連鎖距離為2.1cM，在ms-3xMission群體中與ms-3的連鎖距離為5.2cM。Silberstein等利用F₂代群體繪制了1張包含179個標記的甜瓜分子遺傳圖譜，并將抗蚜蟲基因(Vat)、雄全同株性型基因(a)和控制種子顏色的基因(Wt-2)、心皮數(shù)性狀等基因定位在圖譜上。雌雄同株的表現(xiàn)型由顯性等位基因雄全同株型基因(a)控制，隱性純合體表現(xiàn)為雄全同株。謝震篩選與雌雄同株型(A)連鎖的分子標記，探索了利用分子標記進行甜瓜雌雄同株型自交系輔助選擇的可行性，為利用分子標記技術(shù)輔助甜瓜育種、加快育種進程，開辟了新的技術(shù)途徑。

2.4分子標記輔助選擇

DNA分子標記輔助選擇，是通過利用與目標性狀緊密連鎖的DNA分子標記對目標性狀進行“間接選擇”的現(xiàn)代育種技術(shù)。該技術(shù)可以對作物的“早代”進行準確、穩(wěn)定的選擇，而且可克服再度利用隱性基因時識別難的問題，從而提高育種效率，加速育種進程。由于分子標記的基因型是可以識別的，分子標記對基因型的直接選擇就提供了可能。利用分子標記輔助選擇，首先要將目的基因進行精確定位。在不同的群體中，標記之間的遺傳距離會有所變化，所以要在所研究的材料中根據(jù)已發(fā)表的資料重新對基因定位。如果目標基因與某個分子標記緊密連鎖，那么通過對分子標記基因型的檢測，就能獲知目標基因的基因型。目的基因和標記的遺傳距離應(yīng)不大于10cM，然后以標記的基因輔助選擇。分子標記輔助選擇是分子標記在甜瓜育種應(yīng)用中的最主要方面。

“1998年Weehter等將曾經(jīng)獲得的與抗枯萎病的顯性基因Fore-2連鎖的長度為1.6kb分子標記進行了片段測序(測序的實際長度為1.5Kb)，將其轉(zhuǎn)化為特異性擴增的SCAR標記，建立了甜瓜抗枯萎病分子輔助育種系統(tǒng)?！蓖醯纫訵11983G×Strait8的55個F₂代個體和Iudm1×Strait 8的90個F₂代個體為研究群體，從960對RAPD引物產(chǎn)生的135個多態(tài)性標記中篩選出5個與黃瓜霜霉病基因(dm)緊密連鎖的標記：G14-800、X15-1100、AS5-800、BC519-1100和BC526-1000。

2000年Joobeur等陶利用AFLP和RAPD技術(shù)，將抗甜瓜尖鐮孢枯萎甜瓜專化型病菌0和l型生理小種的Fore-2(Fusarium oxysporm f.sp.melonis)定位于其構(gòu)圖親本MR-1中。Wechter等在甜瓜抗病材料MR-1上獲得了與抗枯萎病生理小種1連鎖的RAPD標記，并成功地將其轉(zhuǎn)化為SCAR標記。Morales等將抗甜瓜壞死斑點病毒NSV標記定位在Oliver構(gòu)建的甜瓜遺傳圖譜的第11連鎖群上，找到與nsv基因緊密連鎖的側(cè)翼標記CTA/ACG-115和OPD08-0.80。遺傳距離是5.9cM。趙長增惻運用ISSR標記技術(shù)，采用分離群體分組分析法(BSA)。對甜瓜抗白粉病基因相連鎖的分子標記進行研究，獲得了1個與甜瓜抗白粉病基因連鎖的ISSR標記，遺傳距離為16.23cM。王建設(shè)等在研究甜瓜抗白粉病基因的分子標記輔助選擇方法時找到1個與抗病基因位點連鎖的分子標記RAPD-S329，其遺傳距離為6.81+1.67cM。程振家利用AFLP技術(shù)和BSA方法相結(jié)合，找到了1個與白粉病抗病基因相連鎖的AFLP標記M60E25-520。利用相關(guān)分析和回歸分析方法分析了F2代群體分子標記和表型性狀的

相關(guān)性，結(jié)果表明，M60E25-520標記與白粉病病情指數(shù)達到了極顯著相關(guān)水平，回歸關(guān)系也達到了極顯著水平，2種分析結(jié)果一致，表明M60E25-520標記與控制甜瓜白粉病抗病基因是緊密連鎖的。

2.5甜瓜作物品種純度及雜種后代的鑒定

作物品種改良是通過攜帶理想性狀的育種材料與需改良的品種雜交，再經(jīng)過選擇而獲得的。甜瓜雜種優(yōu)勢明顯，有效地利用雜種優(yōu)勢是當(dāng)前甜瓜育種的主要途徑。因此，甜瓜作物品種純度和雜種后代的鑒定具有重要的應(yīng)用價值，雜種鑒定不僅是保持甜瓜雜種一代品種遺傳純度的需要，也是縮短育種周期的有效措施吲。品種純度鑒定的常規(guī)方法是依據(jù)田間表型性狀進行鑒定。隨著生化標記的發(fā)展，品種純度及雜種后代的鑒定方法又發(fā)展為利用同工酶方法進行鑒定，但二者都有其不足。近年來分子標記已用于品種純度及雜種后代的鑒定，該技術(shù)可直接把種子的DNA作為檢測對象，在植物體的各個組織、各個發(fā)育時期均可檢測?？蓸擞洈?shù)量多，遍及整個基因組：而且不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在是否表達的問題。RAPD技術(shù)已在甜瓜品種純度及雜種后代的鑒定上得到廣泛研究。許亮對甜瓜雜交種純度進行了RAPD檢測。張紅等從100條隨機引物中篩選出G1：用于甜瓜西域雪2號純度鑒定。帶型偏父。可有效區(qū)分母本和雜交種。從19對SSR引物中篩選出9對穩(wěn)定擴增、多態(tài)性豐富的引物構(gòu)建西域雪1號、西域雪2號的SSR指紋圖譜。劉富中等通過PCR程序優(yōu)化，建立了快速進行甜瓜RAPD分析的技術(shù)體系，從80個隨機引物中選出5個可進行3個甜瓜雜交種純度鑒定的引物。發(fā)現(xiàn)其中1條引物OPM 17可同時用于3個甜瓜雜交種的純度鑒定。建立了3個雜交種的特有指紋圖譜。

3DNA分子標記存在的問題及其在甜瓜育種中的應(yīng)用前景

近年來分子標記在甜瓜育種中的應(yīng)用已經(jīng)取得了一定的進展，分子標記技術(shù)的應(yīng)用可以提高甜瓜育種效率，加快甜瓜育種進程。然而，到目前為止，利用分子標記大規(guī)模培育甜瓜優(yōu)良品系或品種的愿望仍未實現(xiàn)。究其原因，主要有：(1)甜瓜缺乏高密度的遺傳圖譜。(2)數(shù)量性狀標記通用性與準確性有待提高。(3)在分子標記技術(shù)方面，我國與國外差距較大，缺乏開發(fā)自主標記的能力。甜瓜作物已經(jīng)獲得標記的性狀不多。且大多不是基因標記。(4)缺乏分子標記數(shù)據(jù)處理能力，標記鑒定技術(shù)體系的適用化與低成本還需提高。因此，今后甜瓜分子標記工作努力的方向如下：(1)填補連鎖圖上較大間隙，使其更加“飽和”。(2)尋求一些經(jīng)濟實用的新性狀標記，為育種家們提供雜交育種和品種鑒別的實踐依據(jù)。(3)利用SCAR標記等一些標記手段將不穩(wěn)定的標記轉(zhuǎn)化為育種上易利用的穩(wěn)定標記。

近幾年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，其新成果及其發(fā)展的新技術(shù)為我們解決分子標記技術(shù)中存在的問題提供了可能。隨著基因組結(jié)構(gòu)、功能以及生物信息學(xué)等研究的深入，隨著分子標記技術(shù)研究工作的深入發(fā)展和實踐上的需要，它在甜瓜育種中的應(yīng)用將會日益實用和完善。