厚皮甜瓜遺傳多樣性的ＳＳＲ分析

趙　娜　周　晶　楊文才　沈火林　譚　芳　郭　爽　王銀磊

摘要：采用61對SSR特異引物對46份厚皮甜瓜材料進(jìn)行分析，其中52對擴(kuò)增出條帶，47對引物具有多樣性，擴(kuò)增帶分子量在150～1500bp，187條譜帶中154條譜帶具有多態(tài)性。多態(tài)率占82.35％，平均每個引物可擴(kuò)增出3.60條帶。同時，對材料網(wǎng)紋、果形、單果質(zhì)量、有無條帶、果皮顏色、果肉顏色、肉質(zhì)、種子、有無麝香味、裂葉、是否自落和花性型等12個性狀進(jìn)行了田間調(diào)查，經(jīng)過phylip軟件和NTSYS軟件分析后，計算出材料間遺傳距離，并做出SSR分子標(biāo)記和性狀2個聚類圖。結(jié)果顯示，46份材料的遺傳距離在0.0188～1.2119，而單一性狀氣味、果皮顏色、果肉顏色和表面網(wǎng)紋的遺傳距離都小于0.1，十分接近；2種聚類分析結(jié)果存在較大差異。這與供試材料的親緣關(guān)系十分復(fù)雜，大部分材料來源相近，具有相同的親本，和回交親本存在一定關(guān)系。

關(guān)鍵詞：甜瓜；遺傳多樣性；遺傳距離；SSR

甜瓜(Cucumis melo L.)屬葫蘆科(Cueurbitaceae)甜瓜屬(Cueumis)異花授粉植物。在世界各地廣泛種植，是全球十大水果之一，其種質(zhì)資源和變異類型極其豐富。1859年法國分類學(xué)家Naudin首次將甜瓜分為10個族。我國通常把甜瓜分為厚皮甜瓜與薄皮甜瓜2類，其中厚皮甜瓜是我國保護(hù)地和西北地區(qū)經(jīng)常栽培的高效經(jīng)濟(jì)作物之一。SSR(simple sequence repeat)即簡單序列重復(fù)，通常又稱為微衛(wèi)星，其最大特點(diǎn)是檢測的位點(diǎn)多態(tài)性水平較高。而且重復(fù)性較好。2007年，程振家、王懷松等利用AFLP法分析了甜瓜的遺傳多樣性，將供試材料分成了兩大類群，即厚皮甜瓜類群和薄皮甜瓜類群，并進(jìn)一步將厚皮甜瓜類群分成了4個亞類，與甜瓜傳統(tǒng)分類結(jié)果基本一致。2006年，盛云燕、欒非時等用SSR分析了甜瓜的遺傳多樣性，并用NTSYS軟件的立體旋轉(zhuǎn)模擬分析和聚類分析2種方法對結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果基本與形態(tài)學(xué)分類相似。本研究的目的是利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)并結(jié)合田間性狀的觀察，研究厚皮甜瓜的遺傳多樣性，明確供試材料間的遺傳距離，了解材料間遺傳差異，為甜瓜育種中的親本選配以及雜交育種提供理論參考。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)共收集了46份厚皮甜瓜育種材料(自交系)，見表1，具體性狀表現(xiàn)參考表3。試驗(yàn)材料于2007年2月在溫室播種，4月2日定植大棚，每個材料定植20株，植株坐果后隨機(jī)選取10株記載果實(shí)性狀等表型，并提取DNA。

1.2試驗(yàn)方法

利用61對SSR特異引物對表1中的材料進(jìn)行研究。引物序列參見Danin-Poleg、Gonzalo、張紅和Fazio等的文章，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物有限公司提供，Taq酶和dNTP購自北京天根生物技術(shù)公司，PCR-100由Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1.2.1DNA提取從每份材料中隨機(jī)選取植株10株，混合取樣，以幼嫩的葉片為材料提取甜瓜基因組DNA。提取方法采用CTAB小量法。提取完畢后利用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度。并將每個樣品的濃度稀釋到15-25nd/L。

1.2.2SSR分析PCR反應(yīng)總體積為20μL：其中ddH20為14.4μL，10 xbuffer為2μL，2.5 mmol/LdNTP0.8μL，10pmol/L的上、下游引物各0.2μL，模板DNA為2μL，2.5U/uL Taq酶為0.4μL。在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)步驟為：94℃預(yù)變性5min，94℃1min，50℃(45℃，52℃，53℃)45s，72℃1min，36個循環(huán)，72℃5min。反應(yīng)結(jié)束后加入3μL變性膠buffer，95℃變性后置于冰盒中待用。

1.2.3銀染檢測電泳檢測采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)，緩沖液為IOxTBE，恒功率60W，電泳2h左右，銀染檢測，掃描并統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.4田間性狀調(diào)查對46份材料的田間表現(xiàn)性狀進(jìn)行調(diào)查，分別調(diào)查網(wǎng)紋、果形、單果質(zhì)量、有無條帶、果皮顏色、果肉顏色、肉質(zhì)、種子、有無麝香味、裂葉、是否自落和花性型等12個性狀。

1.2.5數(shù)據(jù)處理和分析對擴(kuò)增圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，強(qiáng)反應(yīng)帶記“1”，弱反應(yīng)帶重復(fù)出現(xiàn)記“1”，弱反應(yīng)帶出現(xiàn)但不重復(fù)記“0”，無帶記“0”。用PHYLIP3.67數(shù)據(jù)軟件計算遺傳距離，用NTSYS軟件獲得相似系數(shù)矩陣：用其中UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，并通過Treeplot生成聚類圖。并將田間性狀觀察數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為數(shù)字形式，有性狀的記為“1”。無性狀的記為“0”。利用同樣方法進(jìn)行聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

61對SSR特異引物對46份厚皮甜瓜材料進(jìn)行分析(表2)，其中52對擴(kuò)增出條帶，47對引物具有多樣性，平均每個引物可擴(kuò)增出3.6條帶。等位位點(diǎn)的范圍在1-7個，引物CMAT141、CMCT44、CMGA165和CMTC168的等位位點(diǎn)數(shù)最多，其中以引物CMAT141對樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物為例，其擴(kuò)增條帶的大小在175-450 bp。共有7個等位位點(diǎn)。在所有引物中擴(kuò)增出2個等位位點(diǎn)的有13對引物，占所篩選引物的21.31％，片段大小在100～1250bp。擴(kuò)增出5個位點(diǎn)以上的有16對引物，占所篩選引物的26.22％，片段大小在125～1000 bp；擴(kuò)增出3～4個等位位點(diǎn)的有17對引物，占所篩引物的27.87％，片段大小在100～1500bp。見表2、圖1。

2.2分子聚類與親緣關(guān)系分析

為確定46份甜瓜材料的親緣關(guān)系，分別從基因型和田間性狀兩個方面進(jìn)行了聚類分析。46份甜瓜材料的SSR標(biāo)記的聚類圖，以SSR標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果對46份甜瓜材料進(jìn)行UPGMA聚類分析。從SSR標(biāo)記的聚類圖(圖2)上可以看出，以遺傳相似系數(shù)0.70為標(biāo)準(zhǔn)可將46份厚皮甜瓜的育種材料劃分為6類，第1類包括11份材料(No.21，No.26.No.32，No.36，No.37，No.48，No.72，No.44，No.46，No.74和No.76)，第2類包括16份材料(No.53，No.54，No.41，No.42，No.82，No.58，No.59，No.61，No.60，No.64，No.78，No.79，No.80，No.81，No.69和No.83)，第3類包括3份材料(No.62，No.77和No.71)，第4類包括5份材料(No.27，No.30，No.75，No.73和No.63)，第5類包括7份材料(No.29，No.31，No.38，No.40，No.39，No.55和No.56)，第6類包括4份材料(No.51，No.52，No.84和No.85)；同時，從SSR標(biāo)記的聚類圖上可以看出。這46份厚皮

甜瓜材料的遺傳相似系數(shù)達(dá)到了0.62，說明材料間的親緣關(guān)系還是非常近的。

2.3性狀聚類與親緣關(guān)系分析

選擇甜瓜材料較穩(wěn)定的12個表型性狀包括網(wǎng)紋、果形、單果質(zhì)量、有無條帶、果皮顏色、果肉顏色、肉質(zhì)、種子、有無麝香味、裂葉、是否自落和花性型等，轉(zhuǎn)化為數(shù)字的形式(表3)，對46份甜瓜材料進(jìn)行了UPGMA聚類分析。從性狀聚類圖(圖3)可以看出，一些親緣關(guān)系很近的材料被聚到了一起，例如No.29和No.30、No.31，No.39和No.40。No.51與No.52，No.53和No.54、No.55，No.56和No.59，No.73和No.74。其中No.30是No.29轉(zhuǎn)雌性系的BC5F3.No.31是No.29的BC6 No.40是No.39的BC5:No.52是No.51轉(zhuǎn)雌性系的BC4；No.54是No.53的BC4F2，No.55是No.53的BC4；No.59與No.56，No.73與No.74是姐妹系。以遺傳相似系數(shù)0.70為標(biāo)準(zhǔn)，可以將46份材料劃分為4類：第1類包括No.21、No.73、No.74、No.83、No.32、No.42、No.46、No.84、No.51、No.52、No.77、No.53、No.55、No.54、No.61、No.80、No.79、No.44、No.64、No.69、No.7l、No.81、No.29、No.30、No.31、No.78、No.48等27份材料；第2類包括No.26、No.37、No.63、No.27、No.75等5份材料；第3類包括No.62、No.82、No.76、No.56、No.59、No.58和No.72等7份材料：第4類包括No.38、No.39、No.40、No.41和No.60等5份材料。

2.4遺傳距離分析

利用phvlip3.67軟件對46份材料進(jìn)行了100次的遺傳距離的運(yùn)算，計算材料間的遺傳相似系數(shù)(geneticsimilarity，S)，根據(jù)遺傳相似系數(shù)(GS)計算相應(yīng)的遺傳距離(geneticdistance，GD)。從計算結(jié)果看出，46份材料的遺傳距離值在0.0188～1.2119。其中No.21和No.26的遺傳距離最小，No.41和No.84的遺傳距離最大。一些親本和他們的回交后代如No.29和No.30、No.31，No.39和No.40，No.44和No.46、No.48，No.51和No.52以及No.53和No.54、No.55，它們之間的遺傳距離都比較小，在0.0828～0.4975，而作為雜交壽研1、2、3、4號新品種親本的材料如21號與64號、29號與64號、44號與56號.它們之間的遺傳距離都在0.4以上。

將46份厚皮甜瓜材料按氣味、果皮顏色、果肉顏色和表面網(wǎng)紋等性狀分別進(jìn)行分類，計算單一性狀之間的遺傳距離。不同果皮顏色之間的遺傳距離在0.0564～0.1543，其中白色果皮與淡綠色果皮的遺傳距離最大(表4)；不同果肉顏色之間的遺傳距離在0.0648～0.0931，其中以白色果肉和橘黃色果肉的遺傳距離較大(表5)；表皮不同網(wǎng)紋間的遺傳距離在0.0648～0.0931，其中光皮和密網(wǎng)紋的遺傳距離較大；在氣味方面，有麝香氣味和無麝香氣味的遺傳距離只有0.0391(表6)?？梢钥闯?，單一性狀間的遺傳距離都在0.1000以下，非常小。從SSR標(biāo)記聚類結(jié)果和遺傳距離的計算可以看出，46厚皮份甜瓜材料中大部分的遺傳距離較近，這是由于所用材料是經(jīng)由雜交選育而成的育種材料(自交系)，并且包括很多份親本及其雜交和回交后代。

3討論與結(jié)論

本試驗(yàn)對46份厚皮甜瓜材料進(jìn)行聚類分析并計算出遺傳距離，遺傳距離是研究品種間遺傳差異的重要參考依據(jù)，采用遺傳距離較遠(yuǎn)的優(yōu)良自交系進(jìn)行雜交，改良品種得到具有優(yōu)勢的雜交一代是雜交選育親本的原則之一。從性狀聚類的結(jié)果可以看出：具有相同親本和回交親本的材料遺傳差異較小，例如No.29與它的回交6代No.31.No.39與它的回交5代No.40。No.73、No.74與它們的親本之一No.64.No.75與它的親本之一No.27的親緣關(guān)系都較近，這與樂錦華等對厚皮甜瓜親緣關(guān)系的研究結(jié)果類似。即雜交后代和回交后代易與雙親或是親本之一聚在一起。

本試驗(yàn)選用2種方法對46份材料進(jìn)行了聚類分析。從結(jié)果可以看出，2種聚類結(jié)果存在較大的差異。一些回交后代和雜交后代在性狀聚類中能夠聚在一起。但在分子聚類中卻不一定能聚在一起。例如No.56與它的姐妹系No.58、No.59在分子聚類中沒有聚在一起，在性狀聚類中卻聚在一起。分子聚類的結(jié)果更多的從基因位點(diǎn)的角度反應(yīng)了材料間的親緣關(guān)系，某些位點(diǎn)的差異不一定直接造成性狀表現(xiàn)的差異，性狀的聚類結(jié)果更容易將具有相同表型的材料聚到一起，能明顯揭示形態(tài)上的差異，本試驗(yàn)只調(diào)查了1年的性狀數(shù)據(jù)，因此要想使性狀聚類更加準(zhǔn)確，可以增加調(diào)查的性狀種類。采用幾年調(diào)查的平均值進(jìn)行聚類。分子聚類與表型性狀聚類相比不易受環(huán)境的影響，相對于性狀聚類更加穩(wěn)定；本試驗(yàn)的分子聚類中沒有針對表型性狀選用引物，所用的引物并非直接與這些表型性狀有關(guān)，或者與表型性狀相關(guān)的引物所擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)占全部引物位點(diǎn)比例太小，以致在分子聚類中無法區(qū)分不同的表型性狀，從而導(dǎo)致了2種聚類圖存在了較大的差異。

在結(jié)果的分析中采用phylip3.67軟件進(jìn)行了100次的遺傳距離運(yùn)算從而得出材料間的遺傳距離，通過對不同氣味、果皮顏色、果肉顏色和網(wǎng)紋遺傳距離的計算，可以看出材料的單一性狀間遺傳距離很近，均＜0.2。本試驗(yàn)引物的覆蓋面積較廣，結(jié)果對于親本選配具有一定指導(dǎo)作用。由于這46份厚皮甜瓜材料都是育種材料。之間存在復(fù)雜的親緣關(guān)系，遺傳背景比較狹窄，要想在品種的選育中改變這個缺點(diǎn)，就需要選擇遺傳距離較大的材料進(jìn)行雜交，才能獲得比較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢，同時引入親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的材料來改善育種材料的結(jié)構(gòu)，改變遺傳背景狹窄的局限性。