外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎治療中的研究進(jìn)展*

王繼鋒 段莉 李耀璽 王大平

[關(guān)鍵字]外泌體；骨性關(guān)節(jié)炎；間充質(zhì)干細(xì)胞

隨著人口的老齡化，骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）已經(jīng)成為致殘的重要原因之一，且發(fā)病率逐年上升，被稱為不治之癥。OA 的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，正常人的關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，軟骨細(xì)胞占關(guān)節(jié)軟骨體積的1%～5%，其可分泌Ⅱ型膠原、透明質(zhì)酸等成分，維持細(xì)胞外基質(zhì)的代謝平衡。當(dāng)年齡增大時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性纖維病變，彈性降低，生理結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，軟骨細(xì)胞發(fā)生過(guò)度增殖及肥大化，最終導(dǎo)致不能正常合成聚氨基葡萄糖及透明質(zhì)酸，從而導(dǎo)致軟骨降解及基質(zhì)的丟失[1]。外泌體是一種由細(xì)胞分泌的微囊泡，其在人體中的細(xì)胞或系統(tǒng)之間的交流、調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及對(duì)一些疾病的影響起到重要作用。最新研究表明，不同細(xì)胞來(lái)源的的外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到十分重要的作用。本文就外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎治療的研究進(jìn)展做一綜述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的概念

外泌體（exosome，EXOs）是一種由細(xì)胞分泌的，直徑為30～150 nm 的具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的膜性扁平杯碟狀的微囊小泡，其包含核酸、蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)。最初人們認(rèn)為這些囊泡狀物質(zhì)是細(xì)胞排泄的廢物，但隨著科學(xué)研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)這些微囊泡在生物體細(xì)胞及系統(tǒng)間的通迅交流中起到極其重要的作用[2]。與傳統(tǒng)信息信號(hào)途徑相比，EXOs 是一種細(xì)胞之間更高等級(jí)的交流方式，其作為載體可將miRNA、mRNA 及蛋白質(zhì)等多種大分子或小分子運(yùn)送到靶細(xì)胞中，從而參與人體細(xì)胞或系統(tǒng)間的調(diào)控作用[3]。

1.2 外泌體的分離

EXOs 是通過(guò)多泡體與質(zhì)膜或漿膜融合形成的，直徑為30～150 nm，而微囊泡的形成則是從質(zhì)膜上脫落，直徑為100～1 000nm。2009 年，布魯諾等將MSC 的分泌物對(duì)甘油所致的急性腎損傷的改善作用歸因于微囊泡（80 nm 到1 m之間）的作用。而相比較之下，Lai 等[4]認(rèn)為這是外泌體起到了保護(hù)的作用。這是一種內(nèi)源性的囊泡，并具有外源性的相關(guān)蛋白，如Alix、TGS101 及CD9、CD63 和CD81 等。由于研究EXOs的功能結(jié)構(gòu)需要排除病毒或其他雜質(zhì)蛋白的影響，故如何能最大化地除去雜質(zhì)來(lái)保證分離出外泌體的純度成為關(guān)鍵。而不同的EXOs 提取方法所獲得EXOs 無(wú)論從純度還是從粒子的完整性方面差異均較大。目前，EXOs 的提純分離方法主要分為以下幾種:蔗糖密度梯度離心法;差速超速離心法;化學(xué)沉淀法;凝膠過(guò)濾法;免疫親和法。Labb 等[5]認(rèn)為，使用化學(xué)沉淀法來(lái)提取EXOs 雖然可以獲得大量顆粒，但純度不夠，即所得產(chǎn)物中雖然有大量蛋白質(zhì)，但都不屬于EXOs。而超速離心法可以很好地達(dá)到純度要求，但由于轉(zhuǎn)速過(guò)快導(dǎo)致易破壞EXOs 表面囊泡狀膜結(jié)構(gòu)。此外一些研究表明，可利用免疫親和法來(lái)獲取EXOs?？贵w通過(guò)共價(jià)鍵或高親和力與磁珠相互作用，通過(guò)低速離心或磁性技術(shù)來(lái)進(jìn)行物理分離。Sharma 等[6]開(kāi)發(fā)出了一種新的基于免疫親和的方法來(lái)從患者血漿中的正常細(xì)胞分泌的EXOs 中分離黑色素瘤細(xì)胞分泌的EXOs（MTEX）。

1.3 外泌體的鑒定

2 外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用研究進(jìn)展

2.1 外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎診斷中的研究進(jìn)展

炎癥是OA 滑膜炎導(dǎo)致骨和軟骨破壞的進(jìn)展過(guò)程的關(guān)鍵因素之一。炎癥過(guò)程所產(chǎn)生的一系列促炎細(xì)胞因子、趨化因子及一些基因的表達(dá)在OA 的發(fā)病機(jī)制中起到了特殊作用[8]。Domenis 等的研究表明，滑膜液（synovial fluid,SF）來(lái)源的外泌體可以刺激外周血單核細(xì)胞分化的炎性M1巨噬細(xì)胞分泌IL-1 和IL-16[9]，而IL-1 在OA 發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用已被廣泛認(rèn)識(shí)，IL-1 在OA 滑膜液中的水平顯著升高，這可使其在OA 診斷中起到生物標(biāo)記物的作用[10]。而且，IL-1 在參與OA 發(fā)病機(jī)制中的細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的上游發(fā)揮作用，其可誘導(dǎo)其他幾種促炎反應(yīng)因子（如IL-6 和IL-8）的表達(dá)和釋放，以及基質(zhì)金屬蛋白酶的合成。在這項(xiàng)研究中，Domenis 等還發(fā)現(xiàn)SF 分泌的外泌體能刺激M1 型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生CCL-20、CCL-15 和CXCL1 等趨化因子。CCL-20 能通過(guò)誘導(dǎo)相關(guān)分解基因的表達(dá)和改變軟骨細(xì)胞表型來(lái)發(fā)揮作用，其刺激MMP-13、ADAMTS-5 和COL-X 型mRNA 的表達(dá)，同時(shí)抑制新鮮的體外培養(yǎng)的軟骨組織中COLⅡ型mRNA 的表達(dá)[11]；而CXCL1 在OA 軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[10]，其可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞肥大和凋亡。SF 分泌的外泌體還能刺激M1 巨噬細(xì)胞釋放MMP7 和MMP12。這兩種蛋白酶據(jù)研究發(fā)現(xiàn)與OA 嚴(yán)重程度密切相關(guān)[12-13]。MMPs 是導(dǎo)致軟骨降解的主要酶，而軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解是OA 的最本質(zhì)的特征。以上研究說(shuō)明，外泌體作用于細(xì)胞后產(chǎn)生的相關(guān)細(xì)胞因子可以為診斷骨性關(guān)節(jié)炎提供一個(gè)新思路。

2.2 外泌體在治療骨性關(guān)節(jié)炎中的研究

目前，對(duì)于人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞（ESCMSCs）來(lái)源的EXOs 對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的防治作用機(jī)制研究頗為深入。Wang 等[14]發(fā)現(xiàn)，向C57 小鼠關(guān)節(jié)腔里注射ESCMSCs 可以減輕DMM 模型中的軟骨破壞和細(xì)胞外基質(zhì)的降解。這種作用最終被確定為是ESC-MSCs 分泌的EXOs 發(fā)揮的作用。在IL-1 的存在下，EXOs 通過(guò)增加Ⅱ型膠原的合成以及提高ADAMTS5 的表達(dá)來(lái)維持軟骨細(xì)胞的表型，即ESC-MSCs可以通過(guò)EXOs來(lái)平衡軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，達(dá)到治療OA 的作用，這為OA 的防治以及藥物開(kāi)發(fā)提供了一個(gè)嶄新的思路。有體外實(shí)驗(yàn)證明，在具有免疫活性的大鼠軟骨缺損模型中，人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的EXOs 可促進(jìn)其軟骨再生[15]。結(jié)果 顯示，MSCs-EXOs 可加速軟骨組織的填充以及增強(qiáng)了Ⅱ型膠原蛋白和硫酸糖胺聚糖等基質(zhì)的合成。EXOs 處理過(guò)的大鼠軟骨和軟骨下骨完全修復(fù)，表面規(guī)則，具有透明軟骨的特征。這種透明軟骨可以與周圍的正常軟骨相緊密結(jié)合，渾然一體，并觀察到有大量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積。

2.3 外泌體與骨性關(guān)節(jié)炎的微環(huán)境

有研究表明，低氧是骨性關(guān)節(jié)炎形成的一個(gè)重要因素。其中，低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1 ）通過(guò)激活低氧反應(yīng)元件被認(rèn)為是細(xì)胞適應(yīng)低氧和分解應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[16]。通過(guò)誘導(dǎo)相關(guān)合成因子和抑制一些關(guān)鍵的分解因子來(lái)維持和調(diào)節(jié)軟骨紊態(tài)。例如，HIF-1 可促進(jìn)COX-2、CXCL-2 及IL-1、IL-6 的合成，從而引發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)，HIF-1 通過(guò)NF-/HIF-1 信號(hào)通路上調(diào)MMP2 和MMP9 的表達(dá)。這也說(shuō)明關(guān)節(jié)液和軟骨組織中的HIF-1 在OA 的發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用。有研究表明，在TNF-誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡中，HIF-1 修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體（BMSC-EXOs）對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷具有修復(fù)作用，其可抑制炎癥環(huán)境中軟骨細(xì)胞的凋亡[17]。

上述骨性關(guān)節(jié)炎微環(huán)境的變化也與軟骨細(xì)胞分泌的EXOs 載有的一些蛋白質(zhì)和微小RNA 有關(guān)[18]。MiRNA 是一種單鏈的非編碼的小分子，長(zhǎng)度為20 個(gè)核苷酸左右，其可影響OA 的炎癥反應(yīng)過(guò)程，MSCs-EXOs 中含有大量的miRNA，這在MSCs-EXOs 治療外泌體中發(fā)揮著重要作用，如miR-92a 可通過(guò)增強(qiáng)軟骨細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)軟骨形成而達(dá)到治療OA 的目的[19]。MiR-320 則可以增加軟骨細(xì)胞ECM 合成并下調(diào)負(fù)性調(diào)節(jié)因子（如MMP-13 和ADAMTS-4）的表達(dá)來(lái)減輕OA 的發(fā)生[20]。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，miR-146 加重了促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，同時(shí)抑制了軟骨基質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，其通過(guò)下調(diào)TNF-/ 途徑來(lái)參與OA 進(jìn)程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，用miR-146 抑制劑治療的經(jīng)手術(shù)誘導(dǎo)的OA小鼠，通過(guò)靶向Camk2d和Ppp3r2顯著減輕了關(guān)節(jié)軟骨的破壞。有研究表明，由軟骨細(xì)胞分泌的外泌體中所表達(dá)的Wnt5a 和Wnt5b 通過(guò)選擇性的Wnt 信號(hào)通路激活了Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP），增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但卻降低了軟骨細(xì)胞ECM的分泌。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SMSC-140-EXOs 增強(qiáng)了ACs 的增殖和遷移，卻沒(méi)有降低ECM 的體外分泌的缺點(diǎn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，SMSC-140-EXOs 可以成功阻止大鼠OA 模型疾病的發(fā)生[21]。這些miRNA 既存在于EXOs 中，同時(shí)也參與了MSCs 抑制OA 的炎癥反應(yīng)。這是促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)改善OA的潛在策略[22]。

2.4 不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的影響

關(guān)節(jié)滑膜炎癥和血管生成是OA 發(fā)病的重要因素。有實(shí)驗(yàn)表明，用在IL-1 刺激下的人滑膜成纖維細(xì)胞（synovial fibroblasts，SFB）分泌的外泌體可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞OA 樣基因表達(dá)模式的改變和軟骨降解[23]。與沒(méi)有被IL-1 刺激的SFB 相比，使用IL-1 刺激SFB 后分泌出的外泌體可以使軟骨細(xì)胞中的MMP-13 和ADAMTS5 的表達(dá)顯著上調(diào)，并且下調(diào)了COL2A1 和ACAN。Nanostring 分析表明，IL-1 刺激下的SFB 與未刺激的SFB 分泌的外泌體中有50 種miRNAs 的表達(dá)水平存在差異。這說(shuō)明SFB 可能通過(guò)刺激關(guān)節(jié)軟骨的基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管生成，從而參與血管生成。

Gasado 等研究發(fā)現(xiàn)，利用來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體（BMSC-EXOs）作用于豬的抗炎滑膜炎模型，發(fā)現(xiàn)其最終可以使動(dòng)物模型中滑膜淋巴細(xì)胞減少，抑制T 細(xì)胞分泌TNF-。動(dòng)物模型上的的動(dòng)力學(xué)步態(tài)分析，如擺動(dòng)時(shí)間、步長(zhǎng)時(shí)間和姿態(tài)持續(xù)時(shí)間等參數(shù)也較之前有所改變，說(shuō)明了BMSC-EXOs 在疾病中起到了免疫調(diào)節(jié)的作用[24]。

另有研究比較了誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell-derived MSCs，iMSC）和SMMSCs 兩種細(xì)胞來(lái)源的EXOs 對(duì)OA 的治療作用效果，實(shí)驗(yàn)表明，注射iMSC-EXOs 和SMMSC-EXOs 都能減輕小鼠OA 模型的疾病發(fā)生，但iMSC-EXOs 的治療效果要優(yōu)于SMMSC-EXOs[25]。Gibson 等[26]證明了BMP-2 和Wnt-5a預(yù)處理的ESC 來(lái)源的EXOs 能促進(jìn)大鼠軟骨缺損的修復(fù)。Wang 等也進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)向關(guān)節(jié)內(nèi)注射ESCMSCs 可減輕DMM 模型軟骨破壞和基質(zhì)降解。進(jìn)一步的體外研究表明，這種作用是通過(guò)ESC-MSCs 分泌的EXOs 發(fā)揮作用的。EXOs 通過(guò)增加Ⅱ型膠原合成和降低ADAMTS5的表達(dá)來(lái)維持軟骨細(xì)胞表型[14]。

SMMSCs 來(lái)源于滑膜，具有較高的自我更新能力，因?yàn)榛ず完P(guān)節(jié)軟骨在滑膜關(guān)節(jié)發(fā)育過(guò)程中由共同的細(xì)胞群發(fā)育而來(lái)，因此SMMSCs 比其他MSCs 與軟骨細(xì)胞的關(guān)系更加密切。研究顯示，SMMSCs 比BMSCs 和AMSCs 更適合用于軟骨修復(fù)，體外實(shí)驗(yàn)表明，SMMSC-EXOs 能顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞的遷移和增殖[25]。但其也有缺點(diǎn)，在小鼠OA 模型中，SMMSC-EXOs 處理過(guò)后的軟骨表面不平整，蛋白多糖丟失，淺表區(qū)的軟骨消失，而用iMSC-EXOs 處理軟骨時(shí)未發(fā)現(xiàn)上述情況。更重要的一點(diǎn)是，iMSCs 的獲取途徑可由非侵入性方法獲取，而滑膜SMMSCs 的獲取過(guò)程需要進(jìn)行創(chuàng)傷性的手術(shù)。移植患者特定的iMSC-EXOs 可以避免一些倫理方面的問(wèn)題和免疫抑制相關(guān)的潛在問(wèn)題，并且來(lái)源廣泛，取之不盡，可以滿足臨床需要。

3 小結(jié)與展望

目前，對(duì)于治療OA 的EXOs 療法還處于臨床實(shí)驗(yàn)階段，MSC 還沒(méi)有被正式批準(zhǔn)用于OA。但有600 多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)使用MSC 來(lái)治療OA 是安全的，而對(duì)MSCs-EXOs的深入研究勢(shì)必會(huì)改變現(xiàn)有的OA 的細(xì)胞療法，解決許多與使用活細(xì)胞作為治療藥物的有關(guān)難題，如免疫排斥反應(yīng)，因?yàn)镋XOs 具有最小的免疫原性和毒性[27]。而且，使用EXOs藥物治療這種方式更易被人們所接受。因?yàn)檫@種細(xì)胞外囊泡是人本身身體生理所具有的，它們可以通過(guò)一些非侵入性的途徑，比如口服攝入、鼻腔黏膜給藥，甚至可以吸入給藥。EXOs 藥物更適合商品化，我們可以通過(guò)基因操作來(lái)選擇外泌體的來(lái)源細(xì)胞，從而生產(chǎn)具有無(wú)限繁殖潛力的克隆細(xì)胞系，來(lái)確保可再生的成本效益[28]。然而，在軟骨修復(fù)這個(gè)方面，利用EXOs 治療OA 仍有一些問(wèn)題亟待解決，如向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射EXOs 后對(duì)關(guān)節(jié)腔內(nèi)EXOs 的分布情況和清除速率如何進(jìn)行準(zhǔn)確的評(píng)估目前尚未研究透徹，但不管怎樣，EXOs 未來(lái)在治療OA 的地位肯定會(huì)呈指數(shù)般上升。