椎間盤內(nèi)注射轉(zhuǎn)化生長因子-β1 誘導(dǎo)椎間盤退變

高春華，呂 明，楊 誠，龐曉東，李端明，楊 洪，彭寶淦

椎間盤退變是引起慢性腰痛的主要原因之一，也是一個非常復(fù)雜的生物學(xué)過程。Peng 等［1-3］一系列研究發(fā)現(xiàn)，疼痛椎間盤在細胞的組成和結(jié)構(gòu)上均與無疼痛癥狀的退變椎間盤不同。疼痛的椎間盤首先是一個退變的椎間盤，病理特征性是椎間盤內(nèi)形成富含神經(jīng)纖維的炎性血管化肉芽組織，一些生長因子如堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growing factor，bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)大量表達;老化椎間盤雖然是一個退變的椎間盤，但盤內(nèi)無血管肉芽組織形成，僅有少量生長因子的表達。TGF-β1是一種穩(wěn)定的多功能的多肽生長因子，能提高體外培養(yǎng)的髓核細胞的蛋白多糖合成作用［4］，它們不僅可以控制機體的發(fā)育、生長，還可控制組織的再生和創(chuàng)傷愈合，也能促進組織的不正常改變。在疼痛椎間盤，bFGF、TGF-β1 和CTGF 既在肉芽組織內(nèi)大量表達，也在非肉芽組織部位表達。近期有研究表明，退變椎間盤內(nèi)注射生長因子可以通過改善髓核細胞內(nèi)環(huán)境進而延緩椎間盤退變，但從目前的研究結(jié)果可以看出，生長因子廣泛存在于退變的椎間盤內(nèi)，該物質(zhì)對椎間盤退變的各個時期是否都起到一定的修復(fù)作用亦或可以促進椎間盤的退變尚不得而知。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

10 只6月齡的雄性山羊，平均體重為30 kg。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 腰椎側(cè)位X 線片椎間盤高度變化

拍攝腰椎正側(cè)位X 線片，測量L4/L5/L6/L7椎間隙高度。采用島津500 型數(shù)字X 線機于術(shù)后2、4、6個月時分別觀察測量椎間盤高度指數(shù)(disk height index，DHI)。測量時山羊行全身麻醉后自然放置檢查臺上，以L5椎體為投照中心拍攝山羊腰椎側(cè)位X線片。測量精度0.1 mm。測量及計算方法見圖1。

圖1 DHIFig.1 DHI

1.2.2 椎間盤退行性病變程度

采用德國Siemens 公司1.5T 超導(dǎo)型MRI 掃描儀，置于腰椎掃描表面線圈內(nèi)，自旋回波脈沖系列成像。掃描參數(shù):T2 加權(quán)TR/TE 為4 500/130 ms，矢狀位掃描層厚2 mm，層間隔0 mm;在中矢狀位T2加權(quán)像上運用MRI 掃描儀自帶軟件MR2002M 對椎間盤髓核高信號區(qū)進行描記，自動測量高信號區(qū)面積。

1.2.3 組織學(xué)評價

觀察椎間盤標(biāo)本的組織學(xué)變化，參考Masuda 評分［5］標(biāo)準(zhǔn)，比較3組椎間盤的組織學(xué)評分。

1.3 動物處理

實驗動物肌注速眠新(0.3 mL/kg)和氯胺酮(40 mg/kg)進行全身麻醉，剪去背中部和左肋脅部毛發(fā)，取右側(cè)臥位，手術(shù)區(qū)分別用碘酒和酒精消毒，從肋床下緣約4 cm 偏離椎旁肌2 cm 縱形切開皮膚直到骨盆環(huán)。小心分離皮下組織、腹膜外脂肪和椎旁肌暴露L3～7椎體前外側(cè)(山羊有7 個腰椎)。術(shù)中定位:山羊髂嵴水平正對L7，觸摸到的腰椎間盤前方最凸點為椎間盤前正中點。仔細暴露出L4/L5/L6/L7椎間盤前方纖維環(huán)穿刺點，用皮試針頭經(jīng)椎間盤前正中平行于臨近上下終板小心刺入髓核(刺入髓核時有明顯的落空感)。L4/L5椎間盤注入0.2 mL 生理鹽水作為對照椎間盤，L5/L6椎間盤注入0.2 mL TGF，L6/L7椎間盤注入0.2 mL FGF。完成操作后，用不吸收線逐層縫合深、淺筋膜和皮膚。在整個操作過程中注意不破壞椎體的骨膜組織和上下終板。分別于術(shù)前、手術(shù)結(jié)束時和術(shù)后3 d 肌注青霉素2.5×105U/kg。

1.4 標(biāo)本收集與處理

術(shù)后2、4、6 個月時分別觀察測量一下指標(biāo)所有動物每3周檢測1 次，記錄X 線片上椎間盤的高度指數(shù)和MRI T2 加權(quán)像上的椎間盤高信號區(qū)的面積、椎間盤的形態(tài)學(xué)變化。術(shù)后6 個月通過靜脈注入氯化鉀溶液將其處死，取下L4/L5/L6/L7節(jié)段的椎間盤(切下的范圍包括前縱韌帶、外層纖維環(huán)、纖維環(huán)穿刺道及部分髓核)，并根據(jù)標(biāo)本來自間隙的不同，將標(biāo)本分為L4/L5、L5/L6和L6/L73組。將取下的標(biāo)本分別經(jīng)固定、脫鈣、石蠟包埋并切片之后，對組織病理切片HE 染色、Masson 三色膠原染色和番紅O-固綠染色。觀察3組椎間盤標(biāo)本的組織學(xué)變化。

2 結(jié) 果

2.1 影像學(xué)觀察結(jié)果

2.1.1 X 線結(jié)果

術(shù)后6 個月行腰椎X 線檢查時發(fā)現(xiàn)，L4/L5和L6/L7椎間隙未見明顯變化，無明顯椎間隙變窄及椎體骨贅形成跡象，而L5/L6椎間隙則在術(shù)后6 個月與術(shù)前相比有明顯椎間隙變窄和骨質(zhì)增生反應(yīng)(見圖2)。

圖2 DHI 變化Fig.2 Changes of DHI

2.1.2 MRI 檢查

術(shù)前山羊腰椎序列整齊，椎間盤未見退變征象，椎間隙高度基本一致，術(shù)后6 個月復(fù)查可見腰椎序列紊亂，椎間盤出現(xiàn)高度丟失，體積縮小，椎體邊緣骨橋形成等退變征象。MRI 高信號區(qū)面積變化見圖3。

2.2 組織學(xué)觀察結(jié)果

圖3 MRI 高信號區(qū)面積變化Fig.3 Changes of hyperintense area in MRI

在術(shù)后6 個月將切下的椎間盤標(biāo)本染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，術(shù)后椎間盤即L5/L6椎間盤纖維環(huán)穿刺道內(nèi)有明顯的軟骨樣細胞增生，纖維排列雜亂，髓核含水量減少;而L4/L5和L6/L7椎間盤標(biāo)本在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，纖維環(huán)內(nèi)外層始終分界清楚，表現(xiàn)為正常的板層樣結(jié)構(gòu)。3組椎間盤組織學(xué)評分變化見圖4。

圖4 椎間盤組織學(xué)評分變化Fig.4 Changes of histological scores of intervertebral discs

3 討 論

椎間盤退變發(fā)生率高，危害較大，但確切的發(fā)生機制尚不完全清楚。生長因子在體外能控制細胞的增殖或分化，在體內(nèi)能介導(dǎo)細胞之間的相互作用。它們不僅可以控制機體的發(fā)育、生長，還可控制組織的再生和創(chuàng)傷愈合.但也可促進組織的不正常改變。bFGF、TGF-β 通過各自的受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞等間質(zhì)細胞增殖和合成膠原蛋白，是對創(chuàng)傷修復(fù)具有重要調(diào)控作用的生長因子。bFGF 作為一種重要的促有絲分裂原，它可以直接作用于組織修復(fù)細胞(如成纖維細胞)周期，使細胞G1 期比例下降，S 期和G2+M 期比例增加，使細胞周期轉(zhuǎn)換時間縮短，加速細胞的分裂和增殖。TGF-β 作為一種多功能生長因子，除作為化學(xué)催化劑催化炎性細胞與組織修復(fù)細胞向創(chuàng)面聚集外，本身還能直接作用于成纖維細胞，刺激細胞外基質(zhì)中Ⅰ型前膠原合成、肉芽組織生長以及修復(fù)后期的組織重建等。TGF-β1 是蛋白多糖及膠原代謝等椎間盤細胞外基質(zhì)的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，在椎間盤退變過程中扮演重要角色，既具有誘導(dǎo)某些細胞的促凋亡反應(yīng)，又能增強某些細胞的抗凋亡作用。

但外源性TGF-β1 和bFGF 注入正常椎間盤內(nèi)，椎間盤會發(fā)生何種變化，目前尚無確切報告。本實驗通過將外源性TGF-β1 注入羊L5/L6正常椎間盤內(nèi)，L4/L5椎間盤注入0.2 mL 生理鹽水作為正常對照，L6/L7椎間盤注入0.2 mL FGF 作為陽性對照。通過X 線片測量腰椎DHI，腰椎MRI T2 加權(quán)像測量椎間盤高信號區(qū)的面積和Msuda 椎間盤評分變化，結(jié)果顯示:外源性TGF-β1 可以明顯使椎間盤DHI 降低、核磁椎間盤高信號面積減少，椎間盤病理學(xué)評分增加。FGF組也有變化，但較TGF-β1組改變輕。

本研究結(jié)果顯示外源性TGF-β1 注入正常椎間盤內(nèi)，椎間盤會發(fā)生退行性改變。其原因可能是隨著TGF-β1 濃度升高及其自分泌調(diào)控機制，TGF-β1在椎間盤中的含量也不斷增多，其對膠原合成的正向調(diào)節(jié)作用不斷增強，導(dǎo)致Ⅰ型膠原合成增加量進一步增加，并逐漸取代Ⅱ型膠原，使得髓核承受壓力及形變能力降低，最終整個椎間盤發(fā)生纖維化。這也可能是TGF-β1 導(dǎo)致椎間盤退變機制之一。

另外，TGF-β1 注射進椎間盤內(nèi)，激發(fā)其局部炎癥血管反應(yīng)，炎癥部位的細胞大量產(chǎn)生生長因子，如bFGF 和CTGF 等，這些生長因子作用于與循環(huán)系統(tǒng)隔絕的椎間盤細胞，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進了椎間盤細胞的分化，可能導(dǎo)致椎間盤纖維化和退變。

本實驗樣本量較小，仍需同道對椎間盤退變的確切機制進行進一步研究。

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