青蒿琥酯對肝纖維化小鼠細胞外基質(zhì)的影響

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(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 測試中心，廣東 廣州 510405)

近年研究表明，青蒿琥酯具有抗肝纖維化的作用[1]，本文采用CCL4致小鼠肝纖維化模型，觀察青蒿琥酯對纖維化小鼠肝臟損傷的干預(yù)作用，以期探討青蒿琥酯抗肝纖維化的作用機理。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗動物 同齡SPF級昆明小鼠60只，雌雄各半，體重18～22 g。由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，小鼠許可證號：SYXK(粵)2003-0001，粵監(jiān)證字：2007A013。

1.2 試劑及藥品 四氯化碳(天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號：20061006)，青蒿琥酯(純度99.99%，廣西桂林制藥廠，批號030802)，將青蒿琥酯用5%NaHCO3溶解成12 g·L-1的儲備液，每次實驗前配制成所需濃度，秋水仙素(廣州威佳科技有限公司提供，批號：20070329)，苯巴比妥鈉注射液(廣東邦民制藥廠有限公司 批號060913)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 將60只小鼠隨機分為5組，每組12只，分別為正常組、模型組、青蒿琥酯低劑量組(治療Ⅰ組)、青蒿琥酯高劑量組(治療Ⅱ組)、秋水仙堿組(對照組)。

1.3.2 造模及治療 模型組和用藥組動物按0.005 mL/g體重，皮下注射20%CCL4花生油溶液，每周二，五注射共2次，注射后1 h給予藥物灌胃，青蒿琥酯低劑量組0.014 4 mg/g體重，青蒿琥酯高劑量組0.028 8 mg/g體重[2]，秋水仙堿10-4mg/g體重，正常組和模型組生理鹽水灌胃0.05 mg/g體重。同時在模型組和用藥組飲用水中每250 mL加1支苯巴比妥鈉。

1.4 實驗試劑及方法

1.4.1 試劑配制 (1)Masson復(fù)合染色液：酸性復(fù)紅1 g，麗春紅2 g，桔黃G 2 g，0.25%醋酸300 mL。(2)苯胺藍染色液：苯胺藍1 g，加入100 mL蒸餾水。

1.4.2 方法 Masson三色染色法

1.5 實驗步驟 (1)10%中性多聚甲醛液固定組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。(2)Masson復(fù)合染色液5min。(3)0.2%醋酸水溶液稍洗。(4)5%磷鎢酸5～10 min。(5)0.2%醋酸水溶液浸洗2次。(6)苯胺藍染色液5 min，0.2%醋酸水洗2次。(7)無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。

1.6 圖像分析 應(yīng)用EMAIL-200病理圖象分析軟件，對Masson染色間質(zhì)膠原進行測量。測量內(nèi)容：觀察每100×視野下纖維間隔平均數(shù)目和纖維間隔的平均厚度(um)。每個切片觀察5個視野，取平均值。

2 結(jié)果

正常組，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，圖中可見中央靜脈和匯管區(qū)及肝板結(jié)構(gòu)無破壞，無纖維間隔形成(圖1)。模型組，肝組織中有假肝小葉形成，竇周隙明顯增寬，肝小葉間纖維間隔明顯增寬，中央靜脈和匯管區(qū)的結(jié)構(gòu)遭到一定程度的破壞(圖2)。用藥Ⅰ組(青蒿琥酯低劑量組)，肝組織中有假肝小葉形成，竇周隙和肝小葉間的纖維間隔較寬，但比模型組有所好轉(zhuǎn)(圖3)。用藥Ⅱ組(青蒿琥酯高劑量組)，肝小葉間有纖維間隔形成，竇周隙較寬，但比模型組、用藥Ⅰ組和對照組要明顯好轉(zhuǎn)(圖4)。對照組(秋水仙堿組)，肝組織中有假肝小葉形成，竇周隙和肝小葉間的纖維間隔較寬，但比模型組要有所好轉(zhuǎn)(圖5)。各組小鼠肝組織纖維間隔數(shù)目和纖維間隔寬度見表1。

圖1 正常組 圖2 模型組 圖3 用藥Ⅰ組 圖4 用藥Ⅱ組 圖5 對照組

表1 各組小鼠肝組織纖維間隔數(shù)目及寬度比較

3 討論

結(jié)締組織廣泛分布于人體和動物體內(nèi)，其結(jié)構(gòu)特點是細胞分散，有大量的細胞間質(zhì)纖維和基質(zhì)，而化學(xué)成分是含有大量的蛋白質(zhì)和多糖。Masson三色染色法是常用的顯示細胞外基質(zhì)的染色法，本染色法用苯胺藍代替常用的亮綠，鏡下可見細胞外基質(zhì)為藍色。我們已經(jīng)通過HE染色和電鏡證實青蒿琥酯對肝小葉及肝細胞有很好的保護作用，并能夠明顯減少膠原的形成，防止血竇毛細血管化的作用[3]。本文采用特殊染色法來進一步證實青蒿琥酯對細胞基質(zhì)形成的作用，正常小鼠肝組織的細胞基質(zhì)較少，因此在正常組鏡下發(fā)現(xiàn)肝小葉的結(jié)構(gòu)很難區(qū)別，但在模型組由于膠原的增多，形成了明顯的藍色纖維間隔，青蒿琥酯高劑量組具有明顯降低基質(zhì)中纖維間隔數(shù)目和寬度的作用(P<0.01)。鏡下很容易區(qū)別肝小葉，甚至發(fā)現(xiàn)有假小葉形成，并且發(fā)現(xiàn)肝板間的結(jié)構(gòu)明顯增寬，而用藥Ⅰ組(青蒿琥酯低劑量組)、用藥Ⅱ組(青蒿琥酯高劑量組)和對照組的纖維間隔相對模型組要有所改善，因此認為青蒿琥酯具有明顯抑制細胞外基質(zhì)形成的作用。

[1]來麗娜,方步武.青蒿琥酯抗牛血清白蛋白免疫性大鼠肝纖維化作用的研究[J].中藥藥理與臨床,2006,22(3、4):35-36.

[2]方步武,來麗娜,林雅軍,等.青蒿琥酯抗四氯化碳致大鼠肝纖維化的作用[J].中國藥理學(xué)通報,2005,21(6):762-3.

[3]劉金元.青蒿琥酯對實驗性肝纖維化小鼠形態(tài)學(xué)的影響[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2008,20(5):70-71.