ＳＳＲ標(biāo)記在棉花遺傳育種中的應(yīng)用

單　瑩　那艷斌　何偉鋒　沈　丹　趙　丹

摘要SSR是建立在PCR基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已在棉花研究中被廣泛應(yīng)用。綜述了SSR標(biāo)記的原理與特點(diǎn)，以及其在棉花遺傳圖譜構(gòu)建、功能基因及QTLs定位分析、標(biāo)記輔助育種、種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性分析等方面的應(yīng)用；展望了SSR分子標(biāo)記技術(shù)廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞SSR；棉花；遺傳育種

中圖分類號(hào) S562.032 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739（2009）04-0160-01

SSR（Simple Sequence Repeats）標(biāo)記即微衛(wèi)星標(biāo)記，是由1~6個(gè)核苷酸為單位串聯(lián)重復(fù)而成，長(zhǎng)度一般在200bp以下，兩端為較保守的單拷貝序列。通過(guò)重復(fù)次數(shù)不同及重復(fù)程度不完全相同而呈現(xiàn)多態(tài)性，呈孟德爾式遺傳，共顯性。SSR標(biāo)記廣泛存在于基因組的不同位置，根據(jù)兩側(cè)相對(duì)保守的單拷貝序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳、顯色，便能測(cè)出不同個(gè)體在某個(gè)SSR位點(diǎn)上的多態(tài)性，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行相應(yīng)的分析。棉花基因組中存在豐富的SSR標(biāo)記，而且分布均勻，檢測(cè)出的多態(tài)性頻率較高，已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、分子標(biāo)記輔助選擇等方面的研究。

1SSR的基本原理及特點(diǎn)

微衛(wèi)星DNA由兩部分組成，即核心序列和兩翼的序列，核心序列即前面所稱“重復(fù)”的短序列，兩側(cè)一般是相對(duì)保守的單拷貝序列。在PCR基礎(chǔ)上的SSR分析是根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩翼區(qū)域的序列設(shè)計(jì)位點(diǎn)專一的引物，以總基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠分離，用放射自顯影、銀染或熒光進(jìn)行檢測(cè)。這種序列廣泛分布于真核生物基因組，其重復(fù)次數(shù)的不同就產(chǎn)生了等位基因之間的多態(tài)性。由于SSR兩端多為相對(duì)保守的單拷貝序列，通過(guò)設(shè)計(jì)引物便可以PCR擴(kuò)增，進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。

與其他分子標(biāo)記相比，SSR有以下優(yōu)點(diǎn)：①共顯性遺傳，不易被自然選擇和人工選擇所淘汰，符合孟德爾遺傳定律[1，2]；②多態(tài)性高，可通過(guò)PCR擴(kuò)增呈現(xiàn)出來(lái)，試驗(yàn)程序簡(jiǎn)單，重復(fù)性高；③SSR序列的兩側(cè)序列較保守，在等位基因中多相同，便于重復(fù)利用已知引物；④易于檢測(cè)、重復(fù)性好、可進(jìn)行自動(dòng)化分析，1個(gè)位點(diǎn)一般可在24h內(nèi)完成，且可同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)的檢測(cè)；⑤對(duì)DNA質(zhì)量和數(shù)量的要求不高，僅需微量組織便能有效的分析鑒定。盡管微衛(wèi)星作為分子標(biāo)記有許多優(yōu)點(diǎn)，但同樣存在不足之處，其中一個(gè)最大的麻煩就是必須預(yù)先知道試驗(yàn)材料的基因組信息，至少必須知道重復(fù)序列兩翼的序列信息，才能設(shè)計(jì)出適宜的引物，這大大地限制了它的應(yīng)用。

2SSR標(biāo)記在棉花遺傳育種中的應(yīng)用

2.1SSR標(biāo)記在棉花遺傳圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用

遺傳圖譜（Genetic map）是通過(guò)遺傳重組交換結(jié)果進(jìn)行連鎖分析所得到的基因在染色體上相對(duì)位置的排列圖，是植物遺傳育種及分子克隆等應(yīng)用研究的理論依據(jù)和基礎(chǔ)。而SSR作為一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，由于其豐富的多態(tài)性信息含量，被廣泛的應(yīng)用于棉花遺傳圖譜的構(gòu)建。2008年陳利等[3]利用3 458對(duì)SSR引物篩選陸地棉中棉所35和渝棉1號(hào)間的多態(tài)性引物，獲得了173對(duì)，以多態(tài)性引物檢測(cè)兩者雜交的F2群體180個(gè)單株的標(biāo)記基因型，共獲得178個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)。構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜包括148個(gè)標(biāo)記，36個(gè)連鎖群，總長(zhǎng)1 309.2cm，標(biāo)記間平均距離8.8cm，覆蓋了棉花基因組的29.5%。李朋波等[4]利用70個(gè)SSR標(biāo)記和15個(gè)AFLP標(biāo)記構(gòu)建了總長(zhǎng)為814cm的遺傳圖譜，覆蓋棉花基因組的18.3%。與AFLP標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記通常只擴(kuò)增1個(gè)基因座位，有利于遺傳圖譜之間的比較，這對(duì)于確定連鎖群所屬的染色體及QTL具有比較重要的意義。

2.2SSR標(biāo)記在棉花功能基因及QTLs定位分析中的應(yīng)用

QTLs定位是闡明控制有關(guān)數(shù)量性狀的主要基因數(shù)目，這些基因在染色體上的位置，以及其聯(lián)合效應(yīng)的遺傳圖。高密度SSR連鎖圖的構(gòu)建為基因或QTL定位奠定了基礎(chǔ)。利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)棉花遺傳育種進(jìn)行研究的一個(gè)重要方面就是QTLs定位。利用SSR標(biāo)記技術(shù)，可使棉花育種表型選擇逐步過(guò)渡到基因型選擇，進(jìn)一步利用QTLs定位的成果進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，大大提高育種的效率。楊昶等[5]用5 300對(duì)SSR引物篩選親本多態(tài)，獲得了115個(gè)多態(tài)位點(diǎn)并進(jìn)行標(biāo)記間連鎖分析，構(gòu)建了一張包括20個(gè)連鎖群全長(zhǎng)560.1cm的陸地棉品種間分子標(biāo)記遺傳圖譜。用復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL定位，在苗期檢測(cè)到了3個(gè)抗病QTL，成株期檢測(cè)到9個(gè)與纖維品質(zhì)相關(guān)性狀的QTL及11個(gè)產(chǎn)量構(gòu)成因素的QTL，為棉花抗病育種同時(shí)兼顧產(chǎn)量和品質(zhì)育種提供了非常有用的信息。胡文靜等[6]用陸地棉優(yōu)質(zhì)品系7235、渝棉1號(hào)做親本，以7235×渝棉1號(hào)的F2與F2：3分離群體為材料，從5514對(duì)SSR引物中篩選到117個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，并用其中80個(gè)標(biāo)記構(gòu)建了總長(zhǎng)為1 147.8cm的遺傳圖譜；應(yīng)用復(fù)合區(qū)間作圖分析了該組合的F2單株和F2：3家系纖維品質(zhì)性狀，共檢測(cè)到36個(gè)纖維品質(zhì)QTL。

2.3SSR標(biāo)記在棉花標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用

分子標(biāo)記輔助育種（molecular marker-assisted selection MAS）是現(xiàn)代分子生物學(xué)與傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合，借助分子標(biāo)記對(duì)育種材料從DNA水平上進(jìn)行選擇，從而達(dá)到作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等綜合性狀的高效改良[7]。它是通過(guò)分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記來(lái)判斷目標(biāo)基因是否存在[8]。與傳統(tǒng)的表型性狀選擇相比，標(biāo)記輔助育種具有標(biāo)記基因型鑒定可以在低世代和植株生長(zhǎng)的任何階段進(jìn)行、共顯性的分子標(biāo)記允許在雜合體階段鑒定隱性基因、對(duì)目的基因的選擇不受基因表達(dá)和環(huán)境條件的影響等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用標(biāo)記輔助育種，理論上只要回交3代就可以選到理想的材料。因此，可以加快育種速度，提高選擇效率，特別是對(duì)多基因位點(diǎn)控制的許多重要農(nóng)藝性狀的準(zhǔn)確選擇很有利，同時(shí)對(duì)于開發(fā)高新產(chǎn)品具有重要意義。石玉真等[9]用一個(gè)已定位的高強(qiáng)纖維QTL緊密連鎖的2個(gè)SSR標(biāo)記，在2套雜交組合的不同世代群體中進(jìn)行分析研究，成功培育出9個(gè)纖維優(yōu)質(zhì)的株系。

2.4SSR標(biāo)記在棉花種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性分析中的應(yīng)用

遺傳多樣性是指生物種內(nèi)不同群體之間或群體內(nèi)不同個(gè)體間遺傳變異的總和，它是生物多樣性的基礎(chǔ)和重要組成部分[10]。不同基因型的種質(zhì)材料或棉花品種中存在簡(jiǎn)單重復(fù)核苷酸序列差異，應(yīng)用同一個(gè)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，由于引物互補(bǔ)的模板DNA數(shù)目和位點(diǎn)不同，所擴(kuò)增條帶的數(shù)目和片斷大小就存在差異，從而呈現(xiàn)出多態(tài)性。武耀廷等[11]對(duì)36份陸地棉栽培品種SSR遺傳多樣性研究表明，分子標(biāo)記確定的遺傳關(guān)系基本上與品種系譜的種質(zhì)系統(tǒng)一致，但并不能按系譜或種植生態(tài)區(qū)簡(jiǎn)單的確定品種的歸屬。龐朝友等[12]利用37對(duì)多態(tài)性SSR引物和15個(gè)表型性狀對(duì)155份棉屬種間雜交基因漸滲系及其10份陸地棉親本進(jìn)行了聚類分析，SSR聚類結(jié)果與種質(zhì)材料的系譜來(lái)源基本吻合，而表型性狀聚類結(jié)果與材料系譜來(lái)源相差懸殊。因此，綜合利用SSR、表型性狀聚類結(jié)果將促進(jìn)棉屬種間雜交基因漸滲材料的高效利用。朱四元等[13]利用22對(duì)多態(tài)SSR引物對(duì)14份不同類型的抗蟲棉花材料進(jìn)行擴(kuò)增，運(yùn)用Jaccard遺傳相似系數(shù)計(jì)算14個(gè)品種間的遺傳距離為0.035~1.056，聚類分析表明14份棉花品種可分為2大類4亞類，揭示了大多數(shù)品種的遺傳基礎(chǔ)比較狹窄。陳光等[14]利用24對(duì)擴(kuò)增效果好的引物對(duì)53個(gè)海島棉種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性的檢測(cè)分析，共檢測(cè)出多態(tài)性等位基因變異97個(gè)，占總數(shù)的91.5%，采用UPGMA法對(duì)所選材料進(jìn)行聚類分析表明，53個(gè)品種被分為2大類，與系譜來(lái)源一致，這證明了SSR分子標(biāo)記在鑒別品種和品種遺傳多樣性研究方面具有重要的作用。

3展望

與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，SSR分子標(biāo)記技術(shù)是一種較為快捷、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記。在未來(lái)的發(fā)展中，相信隨著大量可利用的微衛(wèi)星序列的開發(fā)，其在棉花遺傳育種中的應(yīng)用前景會(huì)更加廣闊。

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